NY/T 4475-2025 马铃薯品种真实性鉴定 SSR分子标记法

１　范围
本文件规定了利用简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR)分子标记法进行马铃薯(Solanum
tuberosum L?)品种真实性检测的原则、检测方案、检测程序和结果报告.
本文件适用于马铃薯品种真实性验证和品种真实性身份鉴定,不适用实质性派生品种(EssentialdeＧ
rivedvarieties,EDV)的鉴定.
２　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件.
GB/T３５４３?１　农作物种子检验规程　总则
GB/T３５４３?２　农作物种子检验规程　扦样
GB/T３５４３?５　农作物种子检验规程　真实性和品种纯度鉴定
GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法
GB７３３１　马铃薯种薯产地检疫规程
GB１８１３３　马铃薯种薯
３　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
３?１　
品种真实性验证　varietyverification
与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品的品种名称与标注是否相符.
３?２　
品种真实性身份鉴定　varietyidentification
经SSR分子标记检测并通过已知品种SSR 指纹数据比对平台筛查比较,确定供检样品的真实品种
名称.
３?３　
标准样品　standardsample
国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA 样品.
３?４　SSR 指纹数据比对平台　SSRfingerprintblastplatform
采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测,并运用计算机数据库技术和网络
信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体.
３?５　
参照样品　referencesample
具有SSR位点上主要等位变异的品种,用于辅助确定试验样品的等位变异,校正仪器设备的系统
误差.
３?６　
引物组合　primerpanel
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用来最大能力区分马铃薯品种的所有引物的集合.
４　缩略语
下列缩略语适用于本文件.
bp:碱基对(basepair)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphates)
PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)
PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)
SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)
SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)
TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸二钠(TrisＧBorateＧEDTA)
Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
PVP:聚乙烯吡咯烷酮(PolyvinylＧpyrrolidone)
Taq 酶:耐热DNA 聚合酶(TaqＧDNApolymerase)
５　原理
马铃薯不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异.这种差
异可以通过从试验样品中提取DNA,用SSR 引物进行扩增和电泳,从而利用扩增片段大小不同而区分
品种.
依 据SSR标记检测原理,采用SSR引物,通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方
式,对品种真实性进行验证或身份鉴定.真实性验证依据SSR 位点差异数目而判定,品种真实性身份鉴
定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定.
６　检测方案
６?１　总则
对于真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同.应依
据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,择定适宜的引物、检测平台、样品状况,制订相
应的检测方案.
在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对供检样品按DNA 提取、PCR 扩增、电
泳、数据分析的程序进行检测.
按规定要求填报检测结果,检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息.
DNA 提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检
测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的调整.
６?２　检测平台
６?２?１　对于马铃薯品种真实性验证或身份鉴定,可选择采用变性PAGE垂直板电泳或毛细管电泳,如
需要利用SSR指纹数据比对平台,则需要利用参照样品确定供检样品的指纹后,再进行真实性身份
鉴定.
６?２?２　对于样品数量较大的,可将组织研磨仪、DNA 自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增仪、毛
细管电泳进行组合,以提高检测的综合效率.
６?３　引物
遴选了２４对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物,具体见表１,引物编号为St０１~St２４.
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表１　引物信息
编号引物名称染色体上游引物序列(５′Ｇ３′) 下游引物序列(５′Ｇ３′)
St０１ STM１０４９b １ CTACCAGTTTGTTGATTGTGGTG AGGGACTTTAATTTGTTGGACG
St０２ S７a ２ GACTGGCTGACCCTGAACTC GACAAAATTACAGGAACTGCAAA
St０３ S１９２a ３ ACTTCTGCATCTGGTGAAGC GGTCTGGATTCCCAGGTTG
St０４ S１８７a ４ CCGTTGATGGGATTGCACA TGATATTAACCATGGCAGCAGC
St０５ STI０３２c ５ TGGGAAGAATCCTGAAATGG TGCTCTACCAATTAACGGCA
St０６ S１７０a ７ CGCAAATCTTCATCCGATTC TCCGGCGGATAATACTTGTT
St０７ ３１９２４d ８ CGAAGACACCAAATCGCTCAG GAAACGCCATTAACATTTTACATCG
St０８ S１８９a ９ CCTTGTAGAACAGCAGTGGTC TCCGCCAAGACTGATGCA
St０９ STM００３７b １１ AATTTAACTTAGAAGATTAGTCTC ATTTGGTTGGGTATGATA
St１０ S１１８a １２ AGAGATCGATGTAAAACACGT GTGGCATTTTGATGGATT
St１１ STM２０２２b ２ GCGTCAGCGATTTCAGTACTA TTCAGTCAACTCCTGTTGCG
St１２ STI００１２c ４ GAAGCGACTTCCAAAATCAGA AAAGGGAGGAATAGAAACCAAAA
St１３ SSR０８３３７c ４ CGTTAAGGAGGAGGAGGAAAA CCAAATAACGTGTTGAGCCC
St１４ STPoAc５８b ５ TTGATGAAAGGAATGCAGCTTGTG ACGTTAAAGAAGTGAGAGTACGAC
St１５ S１５１a ６ GCTGCTAAACACTCAAGCAGAA CAACTACAAGATTCCATCCACAG
St１６ S１８２a ６ GGAAGTCCTCAACTGGCTG TCAACTATATGCCTACTGCCCAA
St１７ STM１１０６b １０ TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG ATGCGAATCTACTCGTCATGG
St１８ STG００２６c ７ ACTGCCGCAAAAAGTGAAAA GCCGCTAGGTGGAGTAGATG
St１９ STM１１０４b ８ TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG CAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA
St２０ STM３０１２b ９ CAACTCAAACCAGAAGGCAAA GAGAAATGGGCACAAAAAACA
St２１ STG００２５c １０ TGGAATCCGAATTACGCTCT AGGTTTTACCACTCGGGCTT
St２２ ４３０１６d １１ CAAGCTGCATGAAAGCCATC TTTGCCTAAAAGTTTGTAGTGTGAGG
St２３ STI０１７c １１ TATGGAAATTCCGGTGATGG GACGGTGACAAAGAGGAAGG
St２４ STM５１２１b １２ CACCGGAATAAGCGGATCT TCTTCCCTTCCATTTGTCA
　　注:引物来源,a:YanfengDuanetal?(２０１８);b:YingWangetal?(２０１９);c:ShaoguangDuan(２０１７);d:MasahirKishine
(２０１７).
６?３?１　品种真实性验证允许采用序贯方式,可以先采用引物St０１~St２４进行检测,若检测到可以判定不
符结果的差异位点数的,可终止检测.也可直接采用表１的２４对SSR引物进行检测.
６?３?２　品种真实性身份鉴定是在具备已知品种SSR 指纹数据比对平台的前提下,通过构建供检样品的
指纹,利用SSR指纹数据库比对平台能够筛查确定至具体品种.检测时采用表１的２４对SSR引物进行
检测,与SSR指纹数据比对平台比较筛查与试验样品指纹一致的品种.
６?４　样品
６?４?１　按照GB１８１３３与GB７３３１的要求采集供检样品,供检样品的种苗(薯)数量应不少于５株(粒).
需要扦样的样品数量应符合GB/T３５４３?２的要求.
６?４?２　供检样品可以为马铃薯幼苗、叶片、块茎等组织或器官.供检样品可采用混合样或单个个体,不少
于５个个体.
７　仪器设备、试剂和溶液配制
７?１　仪器设备
７?１?１　DNA 提取
高速冷冻离心机、水浴锅或金属浴、紫外分光光度计、酸度计、组织研磨仪.
７?１?２　PCR 扩增
PCR扩增仪.
７?１?３　电泳
７?１?３?１　毛细管电泳检测平台
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遗传分析仪.
７?１?３?２　变性PAGE垂直板电泳
高压电泳仪、垂直板电泳槽及配套的制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、数码相机或凝胶成像系统.
７?１?４　其他器具
微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、冰箱、染色盒、制冰机、超纯水仪等.
７?２　试剂
７?２?１　DNA 提取
CTAB、SDS、三氯甲烷、异戊醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２?２H２O)、三羟甲基氨基甲烷(TrisＧ
base)、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇.
液氮、聚乙烯吡咯烷酮(PolyvinylＧpyrrolidone,PVP)、CTAB、乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２?
２H２O)、三羟甲基氨基甲烷(TrisＧbase)、βＧ巯基乙醇(βＧmercaptoethanol)、三氯甲烷、异戊醇、氯化钠、乙
醇、盐酸、氢氧化钠.聚乙烯吡咯烷酮(PolyvinylＧpyrrolidone,PVP).
７?２?２　PCR 扩增
模板DNA、dNTPs、Taq 酶、１０×PCRBuffer(含MgCl２)、ddH２O、引物或者２×Taq Mix混合液.
７?２?３　电泳
７?２?３?１　毛细管电泳
与使用的遗传分析仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液.
７?２?３?２　变性PAGE垂直板电泳
去离子甲酰胺(Formamide)、溴酚蓝(BromophenolBlue)、二甲苯青(XylenecyanoleFF)、甲叉双丙
烯酰胺(Bisacrylamide)、丙烯酰胺(Acrylamide)、硼酸(BoricAcid)、尿素、亲和硅烷(BindＧSilane)、疏水硅
烷(RepelSilane)、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、冰醋酸、硝酸
银、甲醛、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(TrisＧbase)、乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２?２H２O).
７?３　溶液配制
DNA 提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液按照附录A 规定的要求进行配制,所用试剂均为分析纯.
试剂配制所用水应符合GB/T６６８２规定的一级水的要求,其中银染溶液的配制可以使用符合三级要
求的水.
８　检测程序
８?１　DNA 提取
８?１?１　CTAB法
选取试验样品的幼苗或叶片３００mg~４００mg,加入液氮迅速研磨成粉末,转入２?０mL的离心管中.
在离心管中加入６５℃预热的CTAB提取液７００μL,按照CTAB∶PVP(V∶m )为１００∶１添加适量PVP,
充分混匀,６５℃水浴６０min,其间多次轻缓颠倒混匀.待样品冷却至室温后,每管加入等体积的三氯甲
烷/异戊醇(２４∶１)混合液,充分混合后静置１０min,在１２０００r/min离心１０min.吸取上清液转移至新
的离心管中,加入等体积的三氯甲烷,充分混合后静置１０min,在１２０００r/min离心１０min.离心后再
次吸取上清液移至新的离心管中,加入等体积的三氯甲烷,充分混合后静置１０min,在１２０００r/min离心
１０min.吸取上清液移至新的离心管中,加入２倍体积预冷的无水乙醇,轻轻颠倒混匀,１２０００r/min离
心５min.弃上清液,７０％乙醇溶液洗涤２遍,自然干燥或在超净工作台上吹干.将干燥的DNA 加入
５０μL超纯水充分溶解,检测浓度并稀释至５０ng/μL~１００ng/μL,置于４℃备用或－２０℃保存.
CTAB法适宜提取马铃薯幼苗、幼嫩叶片等组织或器官DNA.
８?１?２　试剂盒法
选用适宜SSR标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用.DNA 提取方法,按照试剂盒提供的使用
说明进行操作.
马铃薯块茎组织DNA 适宜用多糖多酚DNA 提取试剂盒提取,或者达到８?１?１或者其他达到PCR
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扩增质量要求的方法.
８?２　引物合成
选用变性PAGE垂直板电泳,只需合成普通引物.选用荧光毛细管电泳,需要在上游引物的５′端标
记与毛细管电泳仪发射和吸收波长相匹配的荧光染料.具体引物分组信息见附录B.
８?３　PCR 扩增
８?３?１　反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表２进行配制,可依据试验条件不同做适当调整.
表２　PCR扩增反应体系
反应组分原浓度终浓度推荐反应体积,μL
１０×PCRBuffer(含Mg２＋ ) １０× １× ２?０
dNTPs １０mmol/L ０?４mmol/mL ０?８
Taq 酶５U/μL ０?０５U/μL ０?２
上游引物１０μmol/L １μmol/L １?０
下游引物１０μmol/L １μmol/L １?０
模板DNA ５０ng/μL ５ng/μL ２?０
ddH２O — — １３?０
　　注:使用２×Taq Mix混合液进行PCR 扩增,可直接在反应体系中加入相应的引物和模板DNA,加入量参照表２,用
ddH２O补齐至反应总体积２０μL.
８?３?２　反应程序
反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当的调整.通常采用下列反
应程序:
a)　预变性:９４℃５min,１个循环;
b)　扩增:９４℃变性３０s,６０℃退火３０s,７２℃延伸３０s,每个循环降０?８℃,进行１３次循环;９４℃
变性３０s,５０℃退火３０s,７２℃延伸３０s,进行２４次循环;
c)　终延伸:７２℃延伸１０min.
扩增产物在４℃保存.
８?４　扩增产物分离
８?４?１　荧光毛细管电泳
８?４?１?１　按照预先确定的引物组合,将各引物的扩增产物等比例充分混匀,稀释１倍.吸取稀释后的混
合液１μL,加入遗传分析仪专用９６孔上样板上.每孔再分别加入０?１５μL分子量内标和８?８５μL去离子
甲酰胺,９５℃变性５min,取出立即置于冰上,冷却１０min以上,离心１０s后备用.
８?４?１?２　打开遗传分析仪,检查仪器工作状态和试剂状态.将装有扩增产物的９６孔上样板放置于样品
架基座上,将装有电极缓冲液的buffer板放置于buffer板架基座上,打开数据收集软件,按照遗传分析仪
的使用手册进行操作.遗传分析仪将自动运行参数,并保存电泳原始数据.
８?４?２　变性PAGE垂直板电泳
８?４?２?１　制胶
用洗涤灵和清水将玻璃板反复擦洗干净,再用蒸馏水冲洗干净后,竖置晾干.分别蘸取蒸馏水和
７５％乙醇水平擦拭玻璃板２次,干燥后将亲和硅烷工作液均匀涂满无凹槽的玻璃板表面,疏水硅烷工作液
均匀涂在有凹槽的玻璃板表面.
玻璃板干燥后,将０?４mm 厚的塑料隔条放在无凹槽的玻璃板两侧,盖上凹槽短玻璃板,用夹子将两
侧固定好,用水平仪检测是否水平.量取８０ mL６％ 的聚丙烯酰胺变性凝胶溶液、加入６０μL 的
TEMED、１８０μL１０％的过硫酸铵,轻轻摇匀后,沿着灌胶口轻轻灌入,防止气泡出现.胶灌满玻璃胶室,
在凹槽处将鲨鱼齿梳子的平端插入胶液５mm~６mm.室温下胶聚合１h~１?５h后,轻轻拔出梳子,用
清水洗干净备用.玻璃板规格宜为４５cm×３５cm.
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８?４?２?２　变性
取１０μL扩增产物,加入２μL６×上样缓冲液,混匀.９５ ℃变性５min,取出立即置于冰上,冷却
１０min以上备用.
８?４?２?３　电泳
将胶板安装于电泳槽上,在电泳正极槽(下槽)加入６００mL的１×TBE缓冲液,负极槽(上槽)加入
６００mL的１×TBE缓冲液,拔出梳子,在１８００V 恒压预电泳２０min~３０min.
预电泳结束后,用注射器或吸管吹打胶面,以除去尿素和残胶.将鲨鱼齿梳子的锯齿面插入胶中
１mm~２mm.每一个样品梳加入５μL~８μL变性样品,在１８００V 恒压下电泳.电泳的适宜时间参考
二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见附录C)加以确定.扩增产物片段大小在
(１００±３０)bp、(１５０±３０)bp、(２００±３０)bp、(２５０±３０)bp范围的,电泳参考时间分别为１?５h、２?０h、
２?５h、３?５h.电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻撬开,凝胶附着在无凹槽的玻璃板上.
８?４?２?４　银染
将携带有凝胶的长板放入塑料染色盒内,倒入固定液,置于摇床上轻摇１０min.从固定液中取出凝
胶玻璃板,在蒸馏水中漂洗３０s~６０s.取出胶板移入硝酸银染色液中,轻摇１０min进行染色.然后将胶
板移入去离子水中漂洗３０s~６０s.再移入显影液中,轻轻摇动直至条带出现.待条带清晰,将胶放在胶
片观察灯上观察记录结果,用数码相机或凝胶成像系统拍照保存.
固定液、染色液和显色液的用量以没过胶面为准.
８?５　数据分析
８?５?１　总则
８?５?１?１　电泳结果需要通过规定程序进行数据分析降低误读率.在引物等位变异片段大小范围内(见附
录C),对于毛细管电泳,特异峰呈现为稳定的单峰型、双峰型或连续峰型;对于变性PAGE垂直板电泳,
特异谱带呈现稳定的单谱带、双谱带或连续谱带.
栽培马铃薯为高度杂合同源四倍体,当出现杂合位点时,毛细管电泳中会显示为稳定的２个或多个
峰,在变性PAGE垂直板电泳中显示为稳定的两种或多种谱带.
８?５?１?２　对于位于相应等位变异扩增片段大小范围之外的谱带或峰值,需要甄别是非特异扩增还是新增
的稀有等位变异.采用单个个体扩增的产物,出现５种或５种以上的多谱带或峰值则为非特异扩增;采用
混合样品扩增的产物,某些位点出现５种或５种以上的谱带或峰值,或上下有弱带或左右有弱峰等情况出
现时,则需要通过单个个体进行甄别.
８?５?１?３　对于毛细管电泳,由于不同引物扩增产物表现不同、引物不对称扩增、试验条件干扰等因素影
响,可能出现不同状况的峰型,按照以峰高为主、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别、过滤处置:
a)　对于连带(pullＧup)峰,即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其他颜色荧光峰
值升高的,应预先将其干扰消除后再进行分析;
b)　对于同一位置出现２个相距１bp左右的峰,应视为单峰;
c)　对于高低峰,应通过设定一定阈值不予采集低于阈值的峰;
８?５?１?４　对于变性PAGE垂直板电泳,位于相应等位变异扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非
特异性扩增还是新增的稀有等位变异.采用单个个体扩增的产物,出现５种及５种以上的多带则为非特
异性扩增;采用混合样检测的,某些位点出现５种以上的谱带或上下有弱带等情况出现时,则需要通过单
个个体进行甄别.
８?５?１?５　采取混合样检测的,无论是毛细管电泳还是变性PAGE垂直板电泳,试验样品存在异质性时,
宜采用单个个体独立检测,试样至少含有５个个体.
８?５?２　数据分析和读取
８?５?２?１　毛细管电泳
导出电泳原始数据文件,采用数据分析软件对数据进行甄别.
a)　设置参数:在数据分析软件中预先设置好panel、分子量内标、panel的相应引物的Bin(等位变异
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片段大小范围区间);
b)　导入原始数据文件:将电泳原始数据文件导入分析软件,选择panel、分子量内标、Bin、质量控制
参数等进行分析;
c)　甄别过滤处置数据:按８?５?１的规定执行.
数据比对采用８?５?３?１、８?５?３?２方式的,应分别通过同时进行试验的标准样品、参照样品(依据引物
选择少量的对照),校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小.
８?５?２?２　变性PAGE垂直板电泳
对甄别后的特异谱带进行读取,统一采用分段式数据记录方式.根据每对SSR引物从供检样品中扩
增出的条带大小,按照附录C各SSR引物等位变异位点信息确认PCR扩增位点信息,缺失位点位点数据
记录为０/０.
８?５?３　数据比对
８?５?３?１　采用与标准样品比较的,对甄别后的特异谱带或特异峰(见８?５?１),按照在同一电泳板上的试
验样品与标准样品逐个位点进行两两比较,确定其位点差异.
８?５?３?２　采用与SSR指纹数据比对平台比对的,按照数据导入模板的要求,将数据及其指纹图谱上传到
SSR指纹数据比对平台,进行逐个位点在线比对,核实确定相互间的指纹数据的异同.
采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据库比对平台比对较为困难,建议作为参考使用,比对前采取
以下措施:
a)　读取扩增产物片段大小数据的,供检样品与参照样品(见附录C和附录D)同时在同一电泳板上
电泳;
b)　电泳时间足够,符合８?４?２?３的要求;
c)　供检样品存在扩增片段为一个基序差异的,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取.
８?５?４　数据记录
数据比对后,按照位点存在差异或相同、数据缺失、无法判定等情形,记录每个引物的位点状况.
９　鉴定意见
９?１　检验结果用供检样品和标准样品比较的位点差异数表示.根据检验结果进行鉴定意见判断,一般分
为３类:排除属于同一品种、不确定是否为同一品种和不排除属于同一品种.对于有异议的样品,可以按
照GB/T３５４３?５的规定进行田间小区种植鉴定.
９?２　鉴定意见可参考以下原则:
a)　供检样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数大于３,排除两者为同
一品种;
b)　供检样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为１、２或３,不确定两
者为同一品种;
c)　供检样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为０,不排除两者属于
同一品种.
１０　结果报告
１０?１　按照GB/T３５４３?１的检验报告要求,对品种真实性验证或身份鉴定的检测结果进行填报.
１０?２　对于品种真实性验证,采用下列方式进行填报:
通过对引物,采用电泳方法进行检测,与标准样品比较检测出差异位点数个,差
异位点的引物编号为,鉴定意见为: .
１０?３　对于品种真实性身份鉴定,采用下列方式进行填报:
a)　通过对引物,采用电泳方法进行检测,经与SSR指纹数据比对平台筛查,供检样品
与品种未检测出位点差异,鉴定意见为: .
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b)　通过对引物,采用电泳方法进行检测,经与SSR指纹数据比对平台筛查,检测到供
检样品与品种位点差异个,鉴定意见为: .
c)　通过对引物,采用电泳方法进行检测,经与SSR指纹数据比对平台筛查,未检测到
与供检样品位点一致品种,无法鉴定品种身份.
１０?４　属于下列情形之一的,应在检验报告中注明:
a)　送验样品低于６?４?１规定数量;
b)　与试验样品比较的标准样品的来源;
c)　与SSR指纹数据比对平台进行数据比对;
d)　试验品种异质性严重的位点(引物编号)清单;
e)　检测采用其他SSR引物的名称及序列.
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附　录　A
(资料性)
溶液配制
　
A?１　DNA 提取
A?１?１　１mol/LTrisＧHCl溶液(pH８?０)
称取１２１?１gTris溶于８００mL水中,加入HCl调节pH 至８?０,加水定容至１０００mL,高温高压灭
菌后,室温保存.
A?１?２　０?５mol/LEDTA 溶液(pH８?０)
称取１８６?１gEDTAＧNa２?２H２O 溶于８００mL水中,加入固体NaOH 调节pH 至８?０,加水定容至
１０００mL,高温高压灭菌后,室温保存.
A?１?３　５mol/LNaCl溶液
称取１４６g固体NaCl溶于适量水中,充分搅拌溶解后,加水定容至５００mL.
A?１?４　CTAB提取液
称取２０gCTAB、８１?８２g氯化钠、２gPVP溶于适量水中,量取１mol/LTrisＧHCl(pH８?０)１００mL、
０?５mol/LEDTA(pH８?０)４０mL,调pH 至８?０,加水定容至１０００ mL,高温高压灭菌后,４ ℃保存.
DNA 提取前,按照每１００mLCTAB溶液加入２mLβＧ巯基乙醇在６５℃水浴锅中预热.
A?１?５　三氯甲烷:异戊醇混合液
三氯甲烷、异戊醇两种有机溶剂按体积比２４∶１混匀.
A?１?６　１×TE缓冲液
取１mol/LTrisＧHCL５mL、０?５mol/LEDTA１mL,加HCl调pH 至８?０,加水定容至５００mL,高
温高压灭菌后,４℃保存.
A?１?７　０?１×TE缓冲液
量取２０mL的１０×TE缓冲液,加水定容至２００mL,４℃保存.
A?２　PCR 扩增
A?２?１　SSR 引物
用超纯水分别配制上游引物、下游引物终浓度均为１００μmol/L的保存液.从１００μmol/L的保存液
中分别吸取上、下游引物各１０μL,再分别加入９０μL超纯水配制成１０μmol/L的工作液.
A?３　电泳
A?３?１　６×上样缓冲液
去离子甲酰胺９８mL、０?５mol/LEDTAＧNa２?２H２O 溶液２mL、０?２５g溴酚蓝和０?２５g二甲苯青混
合摇匀,４℃备用.
A?３?２　０?５mol/LEDTA 溶液
称取１８?６１g二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２?２H２O)溶于水中,NaOH 调pH 至８?０,加水定
容至１００mL,高温高压灭菌后,室温保存.
A?３?３　４０％ １９∶１聚丙烯酰胺溶液的配制
称取３８０g的丙烯酰胺,２０g的甲叉双丙烯酰胺溶于适量水中,加去离子水搅拌至完全溶解.加水定
容至１０００mL后,用普通滤纸过滤２次,于４℃避光干燥处保存备用.
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A?３?４　６％变性PAGE胶
称取４２０g尿素、１５０mL的４０％聚丙烯酰胺溶液、１００mL的１０×TBE溶液,加水定容至１０００mL,
过滤后于常温避光干燥处保存备用.
A?３?５　亲和硅烷缓冲液
无水乙醇４９?７５mL和２５０μL冰醋酸混匀,常温避光干燥处保存备用.
A?３?６　亲和硅烷工作液
取亲和硅烷工作１mL、亲和硅烷原液１０μL混匀,现用现配.
A?３?７　剥离硅烷溶液
量取５mL剥离硅烷原液与９５mL的三氯甲烷混匀,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?８　１０％过硫酸铵溶液
称取１g过硫酸铵溶于１０mL水中,４℃保存备用.
A?３?９　１０×TBE缓冲液
称取１０８g三羟甲基氨基甲烷碱、５５g硼酸溶于水中,加入０?５mol/LEDTA 溶液４０mL,加水定容
至１０００mL,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?１０　１×TBE缓冲液
量取１００mL的１０×TBE缓冲液,加水定容至１０００mL,于常温避光干燥处保存备用.
A?４　银染
A?４?１　固定液
２００mL冰醋酸,加水定容至２０００mL.
A?４?２　染色液
２g硝酸银,加水定容至２０００mL.
A?４?３　显色液
３０g氢氧化钠和５mL甲醛,加水定容至１０００mL.
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附　录　B
(资料性)
２４对引物标记四色荧光的引物分组方案
　
２４对引物标记四色荧光的引物分组方案见表B?１.
表B?１　２４对引物标记四色荧光的引物分组方案
组别荧光标记(FAM) 荧光标记(HEX) 荧光标记(ROX) 荧光标记(TAMRA)
１ STM００３７ S７ S１５１ STI００１２
２ S１８９ STM１１０６ STM２０２２ STG００２６
３ S１７０ STM１１０４ S１８７ SSR０８３３７
４ STM１０４９ STPoAc５８ S１９２ STI０１７
５ ３１９２４ S１８２ S１１８ STM３０１２
６ STI０３２ STG００２５ STM５１２１ ４３０１６
　　注１:每个组别的引物可以组合在一起电泳.
注２:荧光染料FAM、HEX、ROX、TAMRA在此仅为示例.
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附　录　C
(资料性)
等位变异扩增片段信息(毛细管电泳)
　
表C?１列出了２４对引物在已知马铃薯品种中扩增片段长度范围、主要等位变异扩增片段大小以及
参照样品对应的等位变异信息.其中参照样品只是列举,考虑到在某一SSR位点多个品种存在相同的扩
增片段大小,确认某一品种在该位点扩增片段大小与参照样品是相同的,该品种也可替代相应的参考样
品.数据采用ABI３７３０毛细管电泳仪器分析获得.
表C?１　已知品种主要等位变异扩增片段信息
引物等位变异扩增片段,bp
编号标记名称重复单元范围片段大小
参照品种名称
St０１ STM１０４９ (ATA)６ １７９~１９９
１７９ 中薯３号
１８６ 高原７号
１８９ 鄂马铃薯５号
１９９ 川芋早
St０２ S７ (CA)n (TC)n １２０~１５２
１２０ 中薯３号
１２８ 中薯３号
１３２ 中薯３号
１３６ 鄂马铃薯５号
１３８ 费乌瑞它
１４２ 米拉
１５２ 米拉
St０３ S１９２ (ATA)n １５７~１７２
１５７ 会Ｇ２
１６０ 会Ｇ２
１６３ 克新１号
１７２ 会Ｇ２
St０４ S１８７ (AAG)n ２１４~２４０
２１４ 中薯３号
２１７ 中薯３号
２２０ 春薯３号
２２６ 春薯３号
２４０ 中薯１８号
St０５ STI０３２ (GCA)n １０７~１２５
１０７ 中薯红１号
１１０ 大西洋
１１６ 高原７号
１１９ 高原７号
１２２ 大西洋
１２５ 会Ｇ２
St０６ S１７０ (GAA)n １０５~１４４
１０５ 中薯３号
１１１ 中薯１８号
１１７ 中薯３号
１２５ 中薯１８号
１２８ 米拉
１４４ 中薯１８号
St０７ ３１９２４ (ATAC)n １６４~２５１
１６４ 中薯３号
２１４ 中薯３号
２１９ 中薯３号
２２３ 中薯３号
２３１ 夏波蒂
２５１ 早大白
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表C?１ (续)
引物等位变异扩增片段,bp
编号标记名称重复单元范围片段大小
参照品种名称
St０８ S１８９ (AAG)n １７６~２０６
１７６ 川芋早
１７９ 蒙薯１０号
１８２ 中薯３号
１８５ 中薯３号
１９１ 川芋早
１９４ 鄂马铃薯１４号
１９７ 蒙薯１０号
２０３ 中薯１８号
２０６ 中薯３号
St０９ STM００３７ (TC)５(AC)６(AA(AC)７(AT)４ ６９~８４
６９ 大西洋
７１ 大西洋
７５ 中薯３号
７７ 中薯３号
８２ 中薯３号
８４ 川芋１０号
St１０ S１１８ Compound(GT/GC)(GT)８ １４１~１６６
１４１ 中薯３号
１４３ 春薯３号
１４９ 春薯３号
１６１ 川芋１０号
１６６ 川芋早
St１１ STM２０２２ (CAA)３?(CAA)３ １７２~２４３
１７２ 大西洋
１７５ 大西洋
１８１ 川芋早
１８７ 大西洋
２２８ 川芋早
２４３ 高原７号
St１２ STI００１２ (ATT)n １６７~１９１
１６７ 早大白
１７０ 闽薯１号
１７３ 早大白
１７５ 闽薯１号
１８５ 早大白
１８８ 宁薯４号
１９１ 中薯红１号
St１３ SSR０８３３７ (TG)n １８３~２０３
１８３ 闽薯１号
１８７ 中薯３号
１８９ 闽薯１号
２０３ 中薯３号
St１４ STPoAc５８ (TA)n ２２８~２４６
２２８ 川芋早
２３２ 中薯３号
２４０ 川芋早
２４６ 中薯３号
St１５ S１５１ (AAG)n ８０~１０５
８０ 中薯３号
８３ 中薯３号
９１ 中薯５号
９７ 中薯３号
１０３ 中薯３号
１０５ 高原７号
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表C?１ (续)
引物等位变异扩增片段,bp
编号标记名称重复单元范围片段大小
参照品种名称
St１６ S１８２ (TCTT)n １３５~１５７
１３５ 春薯３号
１３９ 春薯３号
１４４ 中薯红１号
１５３ 中薯３号
１５７ 中薯３号
St１７ STM１１０６ (ATT)１３ １２２~１９２
１２２ 川芋１０号
１３７ 鄂马铃薯５号
１４０ 鄂马铃薯５号
１５０ 川芋１０号
１５３ 中薯３号
１５６ 大西洋
１５９ 川芋早
１９２ 高原７号
St１８ STG００２６ (CTCC)n ２７８~２９０
２７８ 中薯３号
２８２ 大西洋
２８６ 德薯２号
２９０ 大西洋
St１９ STM１１０４ (TCT)５ １６３~１７７
１６３ 春薯３号
１６５ 夏波蒂
１６８ 夏波蒂
１７２ 川芋１０号
１７５ 春薯３号
１７７ 米拉
St２０ STM３０１２ (CT)４(CT)８ １６６~２０７
１６６ 中薯３号
１９４ 大西洋
１９６ 春薯３号
２００ 中薯３号
２１０ 会Ｇ２
St２１ STG００２５ (AAAC)５ １９４~２０２
１９４ 川芋１０号
１９８ 中薯３号
２０２ 中薯３号
St２２ ４３０１６ (ATCC)n １７７~２３３
１７７ 高原７号
１９３ 川芋１０号
１９７ 川芋早
２０５ 川芋１０号
２０９ 中薯红１号
２２１ 中薯红１号
２３３ 大西洋
St２３ STI０１７ (CAT)n (TAG)n １６３~１７４
１６３ 费乌瑞它
１６６ 费乌瑞它
１６９ 费乌瑞它
１７４ 费乌瑞它
St２４ STM５１２１ (TGT)n ２８３~２９２
２８３ 凉薯１７
２８６ 大西洋
２８９ 大西洋
２９２ 晋薯７号
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附　录　D
(资料性)
参照样品及其等位变异信息
　
参照样品及其等位变异信息见表D?１.
表D?１　参照样品及其等位变异信息
引物编号中薯３号中薯５号中薯１８号
St０１ １７９/１８９ １７９/１８９ １８９
St０２ １２０/１２８/１３２ １５２ １４２
St０３ １６０/１７２ １６０/１７２ １５７/１６０/１７２
St０４ ２１４/２１７ ２１７/２２０/２４０ ２１７/２４０
St０５ １１９/１２２ １１０/１１９/１２２ １１９/１２２
St０６ １０５/１１７/１２８ １２５ １１１/１２５/１４４
St０７ １６４/２１４/２１９/２２３ ２１４/２２３/２５１ １６４/２２３
St０８ １８２/１８５/２０６ １７９/１８２/１８５ １８２/１９１/２０３
St０９ ７５/７７/８２ ６９/７５/７８/８４ ６９/７８/８４
St１０ １４１/１６６ １４３/１４９/１６６ １４１/１４３/１６６
St１１ １８７ １７２/１８７/２２８ １７２/１８７
St１２ １７３ １６７/１７０/１７３ １７３/１８５
St１３ １８７/２０３ ２０３ １８３/２０３
St１４ ２３２/２４６ ２３２ ２３２
St１５ ８０/８３/９７/１０３ ８０/９１/９７ ８０/８３/１０３
St１６ １５３/１５７ １３９/１４４/１５７ １３９/１５７
St１７ １５３ １５０/１５６ １５６
St１８ ２７８ ２７８/２８２ ２７８/２９０
St１９ １６８/１７５ １６８ １６８/１７２
St２０ １６６/２００ １６６ １６６
St２１ １９８/２０２ １９８/２０２ １９８/２０２
St２２ ２０５ １９７/２０５ ２０５
St２３ １６６/１６９/１７４ １６３/１６６/１７４ １６３/１６６/１６９
St２４ ２８９ ２８６ ２８９
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