NY/T 4658-2025 动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程

​​NY/T 4658-2025《动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程》主要内容总结​​

​​1. 标准概述​​

• ​​标准名称​​：动物源副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）分离与鉴定技术规程。
• ​​适用范围​​：适用于猪鼻腔拭子、肺脏、心包液、关节液等样品中副猪嗜血杆菌的分离与鉴定，主要用于细菌耐药性监测。
• ​​归口单位​​：全国兽药残留与耐药性控制专家委员会。
• ​​起草单位​​：华中农业大学、中国兽医药品监察所等多家机构。

​​2. 规范性引用文件​​

• 包括GB/T 6682（实验室用水）、GB 19489（生物安全）、GB/T 34750（副猪嗜血杆菌检测方法）、NY/T 4141（样品采集规程）等。

​​3. 关键试剂与材料​​

• ​​培养基​​：需添加NAD和胎牛血清的TSA/TSB培养基（配方见附录A）。
• ​​试剂​​：NAD溶液、TAE缓冲液、PCR预混液、甘油等。
• ​​标准菌株​​：副猪嗜血杆菌CVCC 3894等3株参考菌株。
• ​​仪器设备​​：生物安全柜、PCR仪、质谱仪（MALDI-TOF MS）、电泳系统等。

​​4. 分离与鉴定程序​​

​​流程图​​（图1）：

1. ​​样品采集与运输​​：按NY/T 4141执行，使用Cary-Blair氏运送培养基保存。
2. ​​分离纯化​​：
   • 样品涂布/划线于含NAD和血清的TSA培养基，36℃培养24-48小时。
   • 挑取针尖大小、灰白色半透明菌落纯化。
3. ​​筛查​​：
   • ​​形态学检查​​：显微镜观察菌体形态。
   • ​​卫星现象试验​​：依赖NAD生长的特性验证。
4. ​​鉴定方法​​（四选一）：
   • ​​生化鉴定​​：按GB/T 34750或商用试剂盒。
   • ​​PCR鉴定​​：靶向16S rRNA基因（821 bp片段），需测序验证（相似度≥98%）。
   • ​​荧光定量PCR​​：特异性引物扩增，Ct值≤29为阳性。
   • ​​质谱鉴定​​：MALDI-TOF MS谱图比对，需达到种水平可信度。

​​5. 菌种保藏​​

• ​​方法​​：甘油（终浓度20-40%）、磁珠保藏管或冻干保护剂（5%蔗糖脱脂乳），-20℃以下保存。

​​6. 生物安全要求​​

• 实验室需符合GB 19489和NY/T 1948，包括设施、人员防护及废弃物处理。

​​7. 附录内容​​

• ​​附录A​​：培养基配制方法（如Cary-Blair运送培养基、TSA/TSB配方）。
• ​​附录B​​：PCR电泳图（821 bp条带）和测序结果示例。
• ​​附录C​​：荧光定量PCR扩增曲线图（Ct值判读标准）。
• ​​附录D​​：质谱鉴定谱图示例。

​​8. 其他要点​​

• ​​质量控制​​：实验需设阳性/阴性对照（如标准菌株和水）。
• ​​可疑结果处理​​：29<Ct≤32时需复核。
• ​​专利声明​​：标准可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。

​​总结​​：该标准系统规定了副猪嗜血杆菌从采样到鉴定的全流程技术方法，强调多方法验证（生化、分子、质谱）和生物安全规范，为动物疫病监测提供标准化操作依据。