NY/T 4656-2025 动物源产气芙膜梭菌分离与鉴定技术规程

《NY/T 4656-2025 动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程》主要内容总结

​​1. 标准概述​​

• ​​标准名称​​：动物源产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）分离与鉴定技术规程。
• ​​适用范围​​：适用于动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中产气荚膜梭菌的分离和鉴定，主要用于细菌耐药性监测。
• ​​归口单位​​：全国兽药残留与耐药性控制专家委员会。
• ​​起草单位​​：中国农业大学、中国兽医药品监察所。

​​2. 规范性引用文件​​

包括GB 4789.13（食品安全标准）、GB/T 6682（实验室用水）、GB 19489（实验室生物安全）、NY/T 1948（兽医实验室生物安全）等。

​​3. 关键试剂与材料​​

• ​​培养基​​：Amies运送培养基、液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）、5%绵羊血琼脂等（配制方法见附录A）。
• ​​标准菌株​​：产气荚膜梭菌毒素C型（CVCC 60101）。
• ​​其他试剂​​：PCR预混液、DNA提取试剂盒、α-氰-4-羟基肉硅酸（HCCA）等。

​​4. 仪器设备​​

• ​​核心设备​​：二级生物安全柜、厌氧培养装置、PCR仪、高速离心机、微生物质谱仪（MALDI-TOF MS）等。

​​5. 分离与鉴定流程​​

1. ​​样品采集与运输​​：按NY/T 4141执行，确保无菌和低温保存。
2. ​​预增菌​​：样品接种FTG培养基，36℃厌氧培养20-24小时。
3. ​​增菌与分离​​：转接TSC琼脂，厌氧培养后挑取黑色单菌落。
4. ​​纯化​​：在5%绵羊血琼脂上纯化，观察溶血环和菌落形态。

​​6. 鉴定方法​​

• ​​形态学检查​​：按GB 4789.13观察菌落特征（如溶血性）。
• ​​生化鉴定​​：使用生化试剂盒或微生物鉴定系统。
• ​​PCR鉴定​​：
  • ​​引物​​：靶向cpa基因（324 bp片段）。
  • ​​条件​​：94℃预变性5分钟，30个循环扩增。
  • ​​结果判定​​：电泳确认324 bp条带，测序相似度≥99%。
• ​​质谱鉴定​​：通过MALDI-TOF MS比对谱图，达到种水平可信度。

​​7. 菌株保藏​​

• ​​方法​​：甘油（20-40%）或磁珠保藏管冻存，-20℃以下保存。
• ​​保护剂​​：5%蔗糖脱脂乳（112℃灭菌）。

​​8. 生物安全要求​​

• 实验室需符合GB 19489和NY/T 1948，包括人员防护、废弃物处理等。

​​9. 附录内容​​

• ​​附录A​​：培养基详细配方（如Amies培养基含硫代乙醇酸钠）。
• ​​附录B​​：PCR电泳图示例及测序结果（324 bp目标片段）。
• ​​附录C​​：产气荚膜梭菌C型标准菌株的质谱谱图。

​​10. 其他说明​​

• 涉及专利时，发布机构不承担识别责任。
• 实验用水需符合GB/T 6682三级水标准。

该标准系统规范了从样品处理到鉴定确认的全流程，强调多方法（生化、PCR、质谱）互补验证，确保结果的准确性和可追溯性。