DB52/T 1869-2025 猪体细胞培养与冷冻保存技术规程

贵州省地方标准DB52/T 1869-2025《猪体细胞培养与冷冻保存技术规程》主要内容总结如下：

​1. 适用范围​

适用于猪耳组织、脂肪组织、肌肉组织的体细胞采集、体外培养、冷冻保存及复苏和活力鉴定，涵盖原代细胞制备、传代培养、冻存与复苏全流程。

​2. 规范性引用文件​

包括实验室安全（GB 19489）、液氮容器（GB/T 5458）、实验用水（GB/T 6682）等国家标准，确保操作合规。

​3. 关键术语与缩略语​

• ​原代细胞​：直接从组织分离的初始培养细胞。
• ​体细胞​：携带个体全部遗传信息的非生殖细胞。
• ​冷冻保存​：通过梯度降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）长期保存细胞。
• ​缩略语​：如PBS（磷酸盐缓冲液）、IF（免疫荧光）、qPCR（实时定量PCR）等。

​4. 实验室基本要求​

• ​分区​：准备室、缓冲间（≥3m²，紫外消毒≥1.5W/m³）、无菌室（C级洁净度，温控20-24℃，湿度45-60%）。
• ​设备与耗材​：超净台、CO₂培养箱、离心机、液氮罐等（附录A）；培养瓶、滤网、冻存管等耗材。
• ​试剂与培养基​：需分析纯及以上，胎牛血清需灭活（56℃ 30分钟），培养基配方见附录B。

​5. 体细胞采集与处理​

• ​供体选择​：健康猪只，组织采集后12小时内处理。
• ​采集方法​：
  • ​耳组织​：酒精消毒后剪耳钳取样。
  • ​脂肪/肌肉组织​：消毒后手术刀取样，生理盐水冲洗。
• ​保存​：4℃ PBS中暂存，标记样本信息。

​6. 体外培养流程​

• ​原代细胞制备​：
  1. 组织剪碎至1mm³，胶原酶消化1小时（37℃水浴）。
  2. 过100μm滤网，离心收集细胞，裂解红细胞（可选）。
  3. 20%完全培养基重悬，铺瓶培养（37℃, 5% CO₂）。
• ​传代培养​：80%融合时胰酶消化，离心后10%培养基重悬，调整密度至1×10⁵个/mL。
• ​细胞鉴定​：
  • ​成纤维细胞​：梭形，IF/qPCR检测标志物。
  • ​脂肪细胞​：脂滴形成，油红染色验证。
  • ​肌卫星细胞​：长梭形，融合成肌管，标志物检测。

​7. 冷冻保存与复苏​

• ​冻存步骤​：
  1. 细胞悬液密度1-3×10⁶/mL，冻存液（70%培养基+20%血清+10% DMSO）分装。
  2. 梯度降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮），登记信息（附录C）。
• ​复苏与活力鉴定​：
  1. 37℃水浴快速解冻，离心清洗后接种。
  2. 台盼蓝染色（0.04%），活细胞拒染，计数3次取平均，活力≥80%为合格。

​8. 附录内容​

• ​附录A​：实验仪器（如离心机、培养箱）与耗材清单。
• ​附录B​：试剂配置（如培养基配方、冻存液）及质量控制要求。
• ​附录C​：冻存/复苏登记表模板，记录品种、代次、活力等关键信息。

​9. 安全与记录​

• 实验全程需符合生物安全标准，紫外消毒≥30分钟。
• 所有操作步骤需详细记录，确保可追溯性。

该标准系统规范了猪体细胞从采集到冻存的全流程技术要点，为遗传资源保存、克隆技术等提供标准化操作依据。