SN/T 1152-2025 鲤春病毒血症检疫技术规范

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　鲤春病毒血症检疫技术规范

　　Quarantine Protocol for the Infection with Spring Viraemia of

　　Carp Virus

　　2025-07-25 发布2026-02-01 实施

　　中华人民共和国海关总署发 布

　　SN/T 1152—2025

　　代替SN/T 1152— 2011

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

　　定起草。

　　本文件代替SN/T 1152— 2011《鲤春病毒血症检疫技术规范》，与SN/T 1152— 2011 相比，除结构

　　调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下：

　　——修改了“实时荧光RT-PCR”检测方法(见9.3);

　　——增加了“逆转录重组酶介导链置换核酸扩增(RT-RAA)”检测方法(见9.4);

　　——删除了“酶联免疫吸附试验(ELISA)”方法;

　　——修改了“综合判定”(见第10 章)。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：深圳海关动植物检验检疫技术中心、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民

　　共和国沈阳海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国烟台海关、深圳技术大学。

　　本文件主要起草人：吴江、孙洁、廖立珊、温智清、耿庆华、尹伟力、岳志芹、林彦星、王津

　　津、阮周曦、贾鹏、郑晓聪、朱鹏、刘荭。

　　本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为：

　　—— SN/T 1152— 2002 ;

　　—— SN/T 1152— 2011。

　　1 范围

　　本文件规定了鲤春病毒血症的采样制样、病毒分离、逆转录聚合酶链式反应、实时荧光逆转录

　　聚合酶链式反应、实时荧光逆转录重组酶介导链置换核酸扩增检测方法和综合判定方法。

　　本文件适用于鲤春病毒血症的诊断、检疫和疫情监测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

　　件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适

　　用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　GB 19489 实验室生物安全通用要求

　　GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CPE ：细胞病变效应(cytopathic effect)

　　Ct 值：阈值循环数(cycle-threshold value)

　　dNTPs ：脱氧核苷酸三磷酸(deoxynucleotide triphosphates)

　　DEPC ：焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)

　　EPC ：鲤鱼上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line)

　　FHM ：胖头鱥肌肉细胞系(fathead monnow cell line)

　　GCO ：草鱼性腺细胞系(grass carp ovary cell line)

　　EDTA ：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)

　　FBS ：胎牛血清(fetal bovine serum)

　　SVC ：鲤春病毒血症(Spring Vireamia of Carp)(见附录A)

　　SVCV ：鲤春病毒血症病毒(Spring Vireamia of Carp Virus)

　　T 值：阈值时间(Time threshold)

　　PEG ：聚乙二醇(polyethyleneglycol)

　　Taq ：水生栖热菌(Thermus aquaticus)

　　2

　　RNA ：核糖核酸(ribonucleic acid)

　　PCR ：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　AMV ：禽成髓细胞性白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)

　　RT-PCR ：逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction)

　　RT-RAA ：逆转录重组酶介导链置换核酸扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification)

　　5 仪器和设备

　　5.1 倒置显微镜。

　　5.2 组织研磨器。

　　5.3 生化培养箱。

　　5.4 光学显微镜。

　　5.5 PCR 扩增仪。

　　5.6 荧光定量PCR 仪。

　　5.7 恒温荧光检测仪。

　　5.8 水平电泳仪。

　　5.9 凝胶成像仪。

　　5.10 低温冰箱。

　　5.11 低温冷冻离心机。

　　5.12 生物安全柜。

　　5.13 高压灭菌锅。

　　6 试剂和材料

　　6.1 水：符合GB/T 6682 中一级水的规格。

　　6.2 SVCV 参考株：世界动物卫生组织参考实验室保存，毒株编号：SVCV20040978。

　　6.3 鱼类细胞系：EPC、FHM 或GCO。

　　6.4 细胞培养液1 ：见附录B.1。

　　6.5 细胞培养液2 ：见附录B.2。

　　6.6 胰酶消化液：见附录B.3。

　　6.7 Taq DNA 聚合酶：生化试剂，-20 ℃保存。

　　6.8 dNTPs ：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmol/L 的混合物，-20 ℃保存。

　　6.9 PCR 反应缓冲液：生化试剂，无Mg2+，-20 ℃保存。

　　6.10 AMV 逆转录酶：生化试剂，-20 ℃保存。

　　6.11 RT-PCR 用引物，浓度为10 μmol/L，用于扩增SVCV G 蛋白基因片段。引物F1 和引物R2 是

　　第一轮PCR 引物，目的产物大小为714 bp ;引物F1 和引物R4 是第二轮PCR 引物，目的产物大小

　　为606 bp。序列如下：

　　——引物SVCV F1 ：5’-TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC-3’;

　　——引物SVCV R2 ：5’-AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY-3’;

　　——引物SVCV R4 ：5’-CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY-3’。

　　6.12 实时荧光RT-PCR 用引物和探针，浓度为10 μmol/L。检测时可任选一对，序列如下：

　　——第一套实时荧光RT-PCR 的引物和探针序列，用于检测SVCV 的N 蛋白基因片段。

　　a)引物SVCV qF1 ：5’-CATGGTATTCTGACGTRGACAA-3’;

　　b)引物SVCV qR1 ：5’-CCATAGGTRTGTTTTATCCATTTGC-3’;

　　3

　　c)探针SVCV qP1 ：5’-FAM-ACGGATGACATGCTCATGATGGCAAA-BHQ1-3’。

　　——第二套实时荧光RT-PCR 的引物和探针序列，用于检测SVCV 的L 蛋白基因片段。

　　a)引物SVCV qF2 ：5’-CAATGGGAATGAGTGCTTCT-3’;

　　b)引物SVCV qR2 ：5’-TGATTTGGTTTTGAATTGTRTC-3’;

　　c)探针SVCV qP2 ：5’-FAM-AGACAGAGGTRAAAGGACATCTGAT-BHQ1-3’。

　　6.13 实时荧光RT-RAA 用引物和探针，浓度为10 μmol/L，用于检测SVCV 的L 蛋白基因片段。序

　　列如下：

　　——引物SVCV-RAA-F ：5’-GGCAAGATTCAGACCAGAACACATACCTAA-3’;

　　——引物SVCV-RAA-R ：5’-CTCAAGAATCGTGGGAAGAAAGGTTCAATA-3’;

　　—— 探针SVCV-RAA-P：5’-GTTGAAGACAGAGGTGAAAGGACATC[FAM-DT][THF]A[BHQDT

　　]TAGAACAGCAGACACAATT-C3 Spacer-3’。

　　6.14 无水乙醇：分析纯，使用前预冷至-20 ℃。

　　6.15 TBE 电泳缓冲液：见附录B.4。

　　7 临床症状及病理变化

　　患病鱼体色发黑，呼吸困难，运动失调(侧游，顺水漂流或游动异常)。腹部膨大，眼球突出，

　　肛门红肿，皮肤和鳃渗血。剖检可见全身出血水肿及腹水。消化道出血，腹腔内积有浆液性或带血的

　　腹水。心、肾、鳔、肌肉等器官或组织呈现出血性炎症，以鳔内壁最常见;肌肉因出血而呈暗红色。

　　8 采样和制样

　　8.1 采样

　　样品优先采集活的、发病的和濒死的鱼，采样数量按照GB/T 18088 规定执行。体长小于4 cm 的

　　取整条;体长4 cm~6 cm 的鱼苗取所有内脏，包括脑和肾;体长大于6 cm 的鱼优先取肾、脾和脑，

　　成熟雌鱼取其卵巢液。

　　样品应尽快送到实验室，有条件尽可能保持鱼的存活;鱼组织需置于4 ℃下冷藏，24 h 内送达实

　　验室。实验室检测条件应符合GB 19489 和GB/T 27401 的规定。

　　8.2 制样

　　使用无菌手术剪刀将样品剪碎并研磨匀浆成糊状，再按照1∶10 的最终稀释度将其重悬于含有

　　1 000 IU/mL 青霉素和1 000 μg/mL 链霉素的细胞培养液1 中，于15 ℃孵育2 h~4 h 或4 ℃孵育6 h~24 h。

　　4 ℃下、12 000 r/min 离心15 min，取上清用于后续实验。

　　9 诊断方法

　　9.1 病毒分离

　　9.1.1 单层细胞的制备

　　用胰酶消化液消化EPC、FHM 或GCO 中的单一细胞后，用细胞培养液2 重悬细胞，在细胞培养

　　板上传代培养EPC、FHM 或GCO 细胞约24 h，形成单层细胞。

　　4

　　9.1.2 接种细胞

　　用细胞培养液2 对1∶10 的组织匀浆上清液再做两次10 倍稀释，然后将1∶10、1∶100 和

　　1∶1 000 3 个稀释度的上清液分别接种至新鲜的EPC、FHM 或GCO 单层细胞。每个稀释度每块板至

　　少接种3 孔，每孔接种100 μL。同时设置阳性对照(接种SVCV 参考株)和空白对照(未接种病毒的

　　细胞)。20 ℃培养，倒置显微镜下连续观察7 d。空白对照细胞应正常，阳性对照细胞应出现典型细

　　胞病变CPE。CPE 表现为病毒在细胞内大量增殖，导致细胞死亡或细胞出现变圆、脱落、聚集等现象。

　　9.1.3 盲传

　　首次接种细胞7 d 后未出现CPE，需进一步盲传。将细胞培养物反复冻融3 次，收集至无菌离心

　　管。4 ℃、7 000 r/min 离心15 min 或用直径0.45 μm 滤器滤除细胞碎片，取上清。用细胞培养液2 将

　　上清液稀释至1∶10 和1∶100，将上清液1∶10 和1∶100 稀释液接种于新鲜的EPC、FHM 或GCO

　　单层细胞，至少3 孔。同时，设立阳性对照和空白对照。20 ℃培养，倒置显微镜下连续观察7 d。

　　9.1.4 结果判定

　　9.1.4.1 空白对照孔细胞形态正常，且阳性对照孔细胞出现CPE，实验有效。否则实验无效，应重

　　新进行实验。

　　9.1.4.2 首次接种细胞和/ 或盲传细胞出现CPE，判定样品的细胞培养分离病毒结果阳性。

　　9.1.4.3 首次接种细胞和/ 或盲传细胞均未出现CPE，判定样品的细胞培养分离病毒结果阴性。

　　9.2 RT-PCR

　　9.2.1 对照设立

　　从核酸抽提起，每步实验均需要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用SVCV 的病毒悬液或核

　　酸作为阳性对照，用正常细胞悬液作为阴性对照，以DEPC 水代替样品作为空白对照。

　　9.2.2 RNA 提取

　　取250 μL 待检样品组织上清液或细胞培养物至无RNA 酶的1.5 mL 离心管，加入600 μL Trizol

　　溶液，剧烈震荡混匀后，室温放置5 min。加入200 μL 氯仿，盖紧盖子，剧烈摇动15 s，室温放置

　　3 min。4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。吸取上清至新的无RNA 酶离心管，加入500 μL 预冷的异丙

　　醇，上下翻转混匀，室温放置10 min。4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。缓慢弃上清，将离心管倒置于

　　吸水纸上，将液体去除。加入1 000 μL 预冷的75 % 乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。4 ℃、12 000 r/min 离心

　　15 min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5 min~10 min。加入20 μL DEPC 水，

　　4 000 r/min 离心5 s，室温溶解10 min。-80 ℃保存备用。

　　在实验过程中，可采用经验证合格的商品化RNA 抽提试剂盒提取核酸。

　　9.2.3 第一轮PCR

　　9.2.3.1 反应体系

　　在冰盒上配制25 μL RT-PCR 反应体系。在PCR 反应管中加入：10×PCR 反应缓冲液(不含

　　Mg2+)2.5 μL，dNTPs( 各10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，引物F1 和引物R2 各1 μL，

　　RNA 酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL，AMV 逆转录酶(5 U/μL)0.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，

　　样品RNA 或对照2.5 μL，加DEPC 水至总体系25 μL，混匀离心后置于PCR 仪中。

　　5

　　9.2.3.2 反应程序

　　50 ℃逆转录30 min ;95 ℃预变性2 min ;95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 个循环;

　　72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。

　　第一轮PCR 反应结束后，可将PCR 产物进行电泳分析，若出现714 bp 大小目的条带，可直接进

　　行测序分析，否则需进行第二轮PCR 扩增。

　　可采用经验证合格的商品化一步法RT-PCR 试剂盒。

　　9.2.4 第二轮PCR

　　9.2.4.1 反应体系

　　在冰盒上配制25 μL PCR 反应体系。在PCR 反应管中加入：10×PCR 反应缓冲液(不含Mg2+)

　　2.5 μL，dNTPs(各10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，引物F1 和引物R4 各1 μL，Taq

　　DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，第一轮PCR 产物或其稀释液2.5 μL，加DEPC 水至总体系25 μL，混

　　匀离心后置于PCR 仪中。

　　9.2.4.2 反应程序

　　95 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。

　　9.2.5 琼脂糖电泳

　　用0.5×TBE 电泳缓冲液配制1.5% 的琼脂糖凝胶，加入适量的电泳核酸染料。分别取5 μL PCR

　　产物与1 μL 6× 载样缓冲液混匀后加入样品孔，使用适当的DNA 分子量标准物作为电泳参照。置于

　　水平电泳仪上5 V/cm 电泳，当载样缓冲液中溴酚蓝指示剂色带迁移至琼脂糖凝胶的2/3 处时停止电

　　泳，用凝胶成像仪观察扩增结果。

　　可使用等效的其他方法，例如毛细管电泳分析仪。

　　9.2.6 测序

　　通过琼脂糖凝胶电泳，分离、回收第一轮和/ 或第二轮PCR 产物的特异性目的条带，测序并对

　　测序结果与参考序列(见附录C.1)或GenBank 数据库SVCV 基因序列进行同源性比较分析。

　　9.2.7 结果判定

　　9.2.7.1 阳性对照第一轮PCR 出现大小为714 bp 的特异性目的条带，和/ 或第二轮PCR 出现大小为

　　606 bp 的特异性目的条带，同时阴性对照和空白对照均无上述特异性目的条带，实验有效。否则实验

　　无效，应重新进行实验。

　　9.2.7.2 样品的第一轮PCR 出现大小为714 bp 的特异性目的条带，或第二轮PCR 出现大小为606 bp

　　的特异性目的条带，且测序结果与参考序列(见附录C.1)或与GenBank 中SVCV G 基因序列同源性≥

　　88%，判定为阳性。

　　9.2.7.3 样品的第一轮PCR 在714 bp 附近无特异性目的条带且第二轮PCR 在606 bp 附近无特异性

　　目的条带，或虽出现与目的条带大小相近的条带但测序结果与参考序列或与GenBank 中SVCV G 基因

　　序列同源性< 88%，判定为阴性。

　　9.3 实时荧光RT-PCR

　　9.3.1 对照设立

　　按照9.2.1 操作。

　　6

　　9.3.2 RNA 提取

　　按照9.2.2 操作。

　　9.3.3 反应体系

　　在冰盒上配制25 μL 反应体系。在PCR 反应管中加入：2× 实时荧光PCR 反应缓冲液10 μL，引

　　物SVCV qF1 和引物SVCV qR1 各1 μL，探针SVCV qP1 0.5 μL 或引物SVCV qF2 和引物SVCV qR2 各

　　1 μL，探针SVCV qP2 0.5 μL，酶混合液1 μL，RNA 模板5 μL，加DEPC 水补足至25 μL。

　　9.3.4 反应程序

　　按照以下程序进行扩增：45 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min ;95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，58 ℃ 采集荧光，

　　40 个循环。每次循环收集一次荧光信号。

　　可采用经验证合格的商品化实时荧光RT-PCR 试剂盒。反应参数可根据反应体系和不同品牌

　　PCR 仪做适当调整。

　　9.3.5 结果判定

　　9.3.5.1 阳性对照Ct 值≤ 36 且有典型的“S”形扩增曲线，同时阴性对照和空白对照无Ct 值无扩增

　　曲线，实验有效。否则实验无效，应重新进行实验。

　　9.3.5.2 样品Ct 值≤ 36 且有典型的“S”形扩增曲线，判定实时荧光RT-PCR 结果阳性。

　　9.3.5.3 样品36 < Ct 值< 40 时，重新取样进行检测。重复检测样品Ct 值< 40，且有典型的“S”

　　形扩增曲线，判定实时荧光RT-PCR 结果阳性;否则为阴性。

　　9.3.5.4 样品无Ct 值或无典型的“S”形扩增曲线，判定实时荧光RT-PCR 结果阴性。

　　9.4 实时荧光RT-RAA

　　9.4.1 对照设立

　　按照9.2.1 操作。

　　9.4.2 RNA 提取

　　按照9.2.2 操作。

　　9.4.3 反应体系

　　在冰盒上配制50 μL 反应体系。在PCR 反应管中加入RT-RAA 反应缓冲液(20% PEG)25 μL，引

　　物RAA-F 2 μL，引物RAA-R 2 μL，探针RAA-P 0.6 μL，去离子水12.9 μL，RNA 模板5 μL，混合均匀

　　后加入到RAA 冻干酶制剂(见附录B.5)的反应管中，混匀，最后加入280 mM 的乙酸镁溶液2.5 μL，

　　充分混匀瞬时离心，将配制好的反应体系在恒温荧光检测仪上进行检测。

　　可采用经验证合格的商品化荧光RT-RAA 试剂盒。

　　9.4.4 反应程序

　　39 ℃ 20 min，反应过程中实时读取荧光信号。

　　9.4.5 结果判定

　　9.4.5.1 阳性对照有荧光对数增长，出现典型扩增曲线，相应的T 值≤ 15 min ;阴性对照和空白对

　　照无扩增曲线出现，实验有效。否则实验无效，应重新进行实验。

　　7

　　9.4.5.2 样品T 值≤ 18 min，且出现典型扩增曲线，判定实时荧光RT-RAA 结果阳性;如被检样品

　　无扩增曲线，判定实时荧光RT-RAA 结果阴性。

　　9.4.5.3 如被检样品18 min < T 值< 20 min，应更换试剂，重新取样进行检测。重复检测结果仍然

　　是18 min < T 值< 20 min，则判定被检样品实时荧光RT-RAA 方法检测阳性;否则为阴性。

　　10 综合判定

　　10.1 疑似病例的判定

　　符合以下任何一项，判定为疑似病例。

　　——临床症状;

　　——细胞培养分离出现典型CPE ;

　　—— RT-PCR 检测结果为阳性;

　　——实时荧光RT-PCR 检测结果为阳性;

　　——实时荧光RT-RAA 检测结果为阳性。

　　10.2 SVCV 感染的判定

　　细胞培养分离出现CPE，且病毒分离物用RT-PCR 或实时荧光RT-PCR 或实时荧光RT-RAA 检

　　测结果为阳性，则判定为SVCV 感染。

　　8

　　附 录 A

　　(资料性)

　　鲤春病毒血症相关信息

　　A.1 病原学

　　SVCV 病毒颗粒呈子弹状，长约70 nm~150 nm，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)水疱病毒属

　　(Vesiculovirus)。病毒基因组为不分节段、负义、单股的RNA，包含有11 019 个核苷酸，编码5 种蛋

　　白[核蛋白(Nucleocapsid protein, N)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基质蛋白(Matrix protein, M)、G

　　蛋白(Glycoprotein, G)和RNA 依赖的RNA 聚合酶(Polymerase protein, L)]。对各地分离出的SVCV

　　毒株部分糖蛋白基因序列进行了分析和系统发育树研究，并根据分析结果将SVCV 分为Ia、Ib、Ic 和

　　Id 4 个亚组。

　　A.2 易感宿主

　　SVCV 宿主范围广泛。能感染四大家鱼和其他几种鲤科鱼，包括鲤(Cyprinus carpio)、锦鲤(Cyprinus

　　carpio koi)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、

　　黑鲫(Carassius carassius)、鲫(Carassius auratus)、丁鱥(Tinca tinca)和欧鲇(Silurus glanis)等。根据

　　易感性排序，鲤为SVCV 最易感宿主，其次是杂交鲤(如鲤和鲫的杂交品种)和鲫、金鱼、草鱼、鳙、

　　鲢等其他鲤科鱼类，最后是易感的非鲤科鱼类。一般来说，1 龄以下的幼鱼最有可能出现疾病的临床

　　症状。

　　A.3 易感阶段、水温、季节等

　　SVCV 通常于春季暴发并引起幼鱼和成鱼死亡，通常在水温8 ℃ ~22 ℃，尤其是在11 ℃ ~17 ℃

　　时流行。在水温17 ℃以上，1 龄或更大规格的鱼感染后无明显症状，不易被察觉，成为SVCV 携带者。

　　鱼苗在22 ℃ ~23 ℃时也能够被感染。该病毒在宿主体外10 ℃的河水中可保持传染性超过5 周，在

　　4 ℃的池塘泥中超过6 周，在10 ℃的池塘泥中存活减少到4 天。

　　A.4 传染源和传播途径

　　SVCV 能通过水平方式传播。传染源为病鱼、死鱼和带毒鱼。主要通过受污染的水或与受SVCV

　　感染的鱼共生而造成水平传播。该病毒可能通过腮进入宿主，随后病毒迅速传播到肝脏、肾脏、脾脏

　　和消化道。

　　9

　　附 录 B

　　(规范性)

　　试剂及其配制

　　B.1 细胞培养液1

　　含有1 000 IU/mL 青霉素、1 000 μg/mL 链霉素和10% FBS 的M199 细胞培养液。M199 培养基，

　　按照说明书的要求配制。然后加入10% FBS 以及相应浓度的抗生素，抽滤除菌，4 ℃保存。

　　B.2 细胞培养液2

　　含有100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和10 % FBS 的Eagle’s MEM 或M199 细胞培养液。

　　MEM 或M199 培养基，按照说明书的要求配制。然后加入10% FBS 以及相应浓度的抗生素，抽滤除菌，

　　4 ℃保存。

　　B.3 胰酶消化液(500 mL)

　　NaCl 4 g

　　KCl(19%) 1 mL

　　Na2HPO4·12H2O 0.126 g

　　Tris 1.5 g

　　以上试剂充分溶解后加双蒸水至500 mL，然后加入胰蛋白酶5 g，最后用1 mol/L盐酸调pH至7.7，

　　完全溶解后过滤除菌分装，-20 ℃保存。

　　B.4 TBE 电泳缓冲液(5×TBE)

　　Tris 54 g

　　硼酸 27.5 g

　　EDTA 2.9 g

　　加双蒸水至 1 000 mL

　　5 mol/L HCl 调pH 至8。

　　B.5 RAA 冻干酶制剂

　　1 mmol/L dNTP、90 ng/μL 单链结合蛋白、120 ng/μL recA 重组酶、30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶、

　　30 ng/μL Exo III、100 mmol/L Tricine、5 mmol/L 二硫苏糖醇、100 ng/μL 肌酸激酶，保存于200 μL 反

　　应管中冻干。

　　10

　　附 录 C

　　(资料性)

　　SVCV 参考序列

　　C.1 RT-PCR 参考序列(SVCV G 基因片段)

　　CCATGCAGCTGAATGGAAAACAACTTGTGATTATAGATGGTATGGACCCCAATACATCACCCACAGT

　　SVCV R2

　　ATTCATCCGATCAGTCCTACCATAGATGAATGCAGGAGAATCATTCAAAGGATTGCATCAGGGACTGATG

　　AAGATCTGGGGTTTCCCCCTCAAAGTTGCGGATGGGCATCTGTCACAACGGTGTCAAATACTAATTATAG

　　SVCV R4

　　AGTAGTACCCCATTCTGTTCATTTAGAGCCATATGGAGGACATTGGATCGATCACGAATTTAATGGGGGC

　　GAATGCAGAGAAAAAGTGTGCGAAATGAAAGGGAATCACTCTATTTGGATCACAGAGGAGACTGTACAG

　　CATGAGTGTGCAAAACATATAGAGGAAGTTGAAGGAATTATGTACGGGAATGTTCCAAGAGGGGATGTA

　　ATGTATGCTAACAACTTTATTATAGATAGACATCACAGAGTATACAGATTCGGGGGATCTTGTCAGATGA

　　AATTCTGTAATAAAGATGGTATAAAATTCGCGAGAGGAGACTGGGTAGAGAAAACAGCCGGAACATTAA

　　CAACGATTCATGACAATGTGCCTAAATGTGTTGATGGAACGTTGGTCTCCGGTCACCGCCCCGGATTAGA

　　CTTGATTGACACAGTCTTCAATTTGGAAAATGTAGTGGAATATACTTTGTGTGAAGGGACTAAAAGGAAA

　　ATCAATAAACAAGAGAAGCTGACATCAGTGGATTTGAGCTATTTGGCTCCAAGAATCGGAGGGTTCGGA

　　SVCV F1

　　TCAGTATTTAGAGTGAG

　　C.2 第一套实时荧光RT-PCR 参考序列(SVCV N 基因片段)

　　GAGGCTTCGTACCTGGTGAGTGAGGAGCCAAAAAGTCGATCTGTCGTTGAATGGATCGCATGGTATT

　　CTGACGTAGACAACAAACCCACGGATGACATGCTCATGATGGCAAAAAGAGTAGCAGGGACTATCTCAG

　　SVCV qF1 SVCV qP1

　　GGCCTCGTGATAACTCAGTGGGCAAATGGATAAAACAAACCTATGGATAAAGATAGTCACATCACACTG

　　SVCV qR1

　　AGATAATTTTAGGTTATAAAAGAAGTAGTAGTTGA

　　C.3 第二套实时荧光RT-PCR 参考序列(SVCV L 基因片段)

　　CGGCAGCTCTGAATATTTCAATGGGAATGAGTGCTTCTAATCTGTTGAAGACAGAGGTGAAAGGAC

　　SVCV qF2 SVCV qP2

　　ATCTGATTAGGACAGCAGACACAATTCAAAACCAAATCATCCGGGAGGCAGCGG

　　SVCV qR2

　　C.4 实时荧光RT-RAA 参考序列(SVCV L 基因片段)

　　GTGGAAATCCCAAGCTGGCAAGATTCAGACCAGAACACATACCTAAAATCATCGAGGATCCTGCCG

　　SVCV RAA-F

　　CTTTGAATATTTCAATGGGAATGAGTGCTTCTAATCTGTTGAAGACAGAGGTGAAAGGACATCTGATTAG

　　AACAGCAGACACAATTCAAAACCAAATCATCCGGGAGGCAGCGGAGTATCTGGGACAAGAGGAAGCAT

　　SVCV RAA-P

　　11

　　CTCTGAATGAGTTCTTGTGGGATATTGAACCTTTCTTCCCACGATTCTTGAGTGAATTCCGAAGCAGTACC

　　SVCV RAA-R

　　TTTGTTGGGGTTACTGACTCTCTCA