T/CVMA 241-2025 爬行动物血细胞人工计数操作规程

　　ICS 11.220

　　CCS B 41

　　团体标准

　　T/CVMA 241—2025

　　爬行动物血细胞人工计数操作规程

　　Manual procedure for counting blood cells in reptiles

　　2025 - 5 - 19 发布 2025 - 5 - 19 实施

　　中国兽医协会 发布

　　T/CVMA 241—2025

　　I

　　前言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由北京中农大动物医院有限公司提出。

　　本文件由中国兽医协会归口。

　　本文件起草单位：北京中农大动物医院有限公司、中国农业大学、北京农业职业学院。

　　本文件主要起草人：张雪芳、林嘉宝、刘洋、马文、吕艳丽、夏兆飞。

　　T/CVMA 241—2025

　　1

　　爬行动物血细胞人工计数操作规程

　　1 范围

　　本文件规定了爬行动物各类血细胞识别、人工计数、血细胞比容测定等血液常规指标的检测方法。

　　本文件适用于爬行动物血液学分析。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　红细胞比容 packed cell volume;PCV

　　红细胞占全血容量的百分比。

　　3.2

　　红细胞平均体积 mean corpuscular volume;MCV

　　单个红细胞的平均体积。

　　3.3

　　红细胞平均血红蛋白浓度 mean corpuscular hemoglobin concentration;MCHC

　　每升红细胞中所含血红蛋白克数。

　　3.4

　　红细胞平均血红蛋白量 mean corpuscular hemoglobin;MCH

　　每个红细胞内所含血红蛋白的平均量。

　　4 爬行动物血细胞组成

　　爬行动物血细胞组成如下：

　　——红细胞;

　　——白细胞：异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞(包括嗜苯胺蓝

　　细胞);

　　——凝血细胞。

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　　2

　　5 爬行动物血液常规指标

　　爬行动物血液常规指标包括：

　　——细胞数量：红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、凝血细胞计数(Thr);

　　——白细胞分类计数(各类白细胞所占百分比和绝对值);

　　——血红蛋白(HB);

　　——红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)。

　　6 准备

　　6.1 器材和试剂

　　6.1.1 器材

　　显微镜、毛细血管离心机及读卡器、高速离心机、分光光度计、移液器(20 μL、100 μL 、1 000 μL)、

　　血液混匀仪、Neubauer血细胞计数板和血盖片、带盖的培养皿、滤纸、5 mL离心管、棉棒、载玻片、盖

　　玻片、比色皿、擦镜纸、毛细离心管、黏土。

　　6.1.2 试剂

　　Natt-Herrick’s溶液(可购买或配制，配制方法详见附录A)、Drabkin试剂、瑞氏-吉姆萨染色液、

　　肝素锂抗凝采血管或EDTA抗凝采血管、蒸馏水。

　　6.2 标本准备

　　6.2.1 抗凝剂的选择

　　抗凝剂的选择如下：

　　——根据物种和品种选择不同的抗凝剂;

　　——常用肝素锂和EDTA，若EDTA 可能会导致部分爬行动物溶血时，宜选择肝素锂;

　　——用肝素锂抗凝的爬行动物血液制作血涂片，染色后可能整个背景偏蓝色，且白细胞和凝血细胞

　　有聚集现象。

　　示例：角鳖(Apalone spinifera)EDTA 抗凝血溶血，缅甸蟒(Burmese Python)EDTA 和肝素抗凝血没有溶血区别，

　　绿鬣蜥(Green iguana)EDTA 抗凝血无溶血反应。

　　6.2.2 血液标本

　　血液标本的制备应注意以下事项：

　　——通常用血量0.5 mL ~ 1 mL，健康动物血液总量约占体重4 % ~ 6 %，采集不超10 %的血液总

　　量是安全的;

　　——血液标本应无淋巴液污染，若有淋巴液污染应弃用并重新采集;

　　——疾病状态下血液量根据动物身体状态灵活选择;

　　——应采集后用新鲜血液立即制作血涂片;

　　——如果不能立即对抗凝全血进行检测，应将血保存在4 ℃，并在采集后的24 h 内进行检测。

　　7 红细胞计数

　　T/CVMA 241—2025

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　　红细胞计数按以下步骤操作：

　　a) 取 4 mL Natt-Herrick’s 溶液到5 mL 离心管中;

　　b) 吸取 20 μL 混匀抗凝全血，擦拭吸头尖端的外部，将全血打入Natt-Herrick’s 溶液中;

　　c) 孵育 15 min ~ 30 min;

　　d) 使用血液混匀器或手动轻轻上下翻转将液体混匀;

　　e) 使用干净、干燥的血细胞计数板，固定血盖片，用移液器吸取少量混匀液放入血细胞计数板，

　　避免气泡进入;

　　f) 将滤纸放在培养皿中，用蒸馏水轻轻润湿滤纸;

　　g) 将棉拭子头掰掉，将2 根棉棒棍，放在带盖培养皿的底部;

　　h) 装载血的血细胞计数板架在棉棒棍上，盖上培养皿避免脱水;

　　i) 等待 5 min，细胞沉淀;

　　j) 显微镜(400 ×)计数：计数中央大方格的四角和正中共5 个中方格(含80 个小方格)内的红

　　细胞。计数时，若红细胞压在方格边线上，计上不计下、计左不计右。若各中方格内红细胞数

　　相差超过均值的±10%，宜重做。对观察到的白细胞不计入。

　　k) 计算：红细胞计数(RBC)用一个保留两位小数的数值×1012/L 表示，计算公式见公式(1)：

　　RBC(/L)= N5WBC / 5 ×25 ×200 ×107 ……………………………(1)

　　式中：

　　N5RBC——5 个中方格的红细胞总数;

　　N5RBC/5×25——中央大方格内的红细胞总数;

　　200——稀释倍数;

　　107——0.1 μL 和L 单位转换。

　　8 红细胞比容(PCV)

　　红细胞比容检测按以下步骤操作：

　　a) 把毛细离心管一端放入混匀的抗凝全血中，使血液吸到毛细离心管的三分之二位置;

　　b) 擦拭毛细离心管管壁;

　　c) 毛细离心管一侧末端用黏土密封;

　　d) 将密封好的毛细离心管放入离心机中，堵塞的一端朝外，10 000 r/min 离心5 min;

　　e) 离心后的血在离心管中分为三层，上层为血浆，中间层为白细胞和凝血细胞，下层为红细胞;

　　f) 使用读卡器测量：黏土一端对准读卡器的底端，血浆顶部对准读卡器最上方，位置刻度对准中

　　间淡黄层最下方，读数，用两位小数或百分比表示，如0.42 或42%。

　　9 红细胞平均体积(MCV)

　　MCV的计算见公式(2)：

　　MCV (fL)= PCV / RBC ×1015 ……………………………(2)

　　式中：

　　PCV——红细胞比容;

　　RBC——红细胞计数;

　　1015——fL 和 L 单位转换。

　　10 红细胞比容(PCV)

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　　血红蛋白测定用氰化血红蛋白法，按以下步骤操作：

　　a) 吸取 6 μL 混匀全血和600 μL Drabkin 试剂，混合均匀，室温下孵育至少1 h;

　　b) 将上述混合液放入离心机中;

　　c) 10 000 r/min 离心10 min，使降解的蛋白质沉淀;

　　d) 以纯 Drabkin 试剂做空白，将分光光度计调零，用分光光度计在540 nm 处读取吸光度;

　　e) 血红蛋白计算见公式(3)：

　　Hb(g/L)= (A540‑ Ablank ) ×(WHB×DF)/(CE ×d ×1000)……………………………(3)

　　式中：

　　A540——被测溶液在540 nm 处的吸光度;

　　ABlank——空白液体(Drabkin 试剂)在540 nm 下的吸光度;

　　WHB——Hb 四聚体的分子量(64 458);

　　DF——稀释系数(101);

　　CE——三聚氰甲烷血红蛋白在540 时的消光系数nm(44);

　　d——以cm 为单位的光路值(1);

　　1 000——mg 和g 单位转换。

　　11 红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)

　　MCHC的计算见公式(4)：

　　MCH (g/L)= HB / PCV ……………………………(4)

　　式中：

　　HB——血红蛋白;

　　PCV——血细胞比容。

　　12 红细胞平均血红蛋白量(MCH)

　　MCH含量的计算见公式(5)：

　　MCH (pg)= HB / RBC ×1012 ……………………………(5)

　　式中：

　　HB——血红蛋白;

　　RBC——血细胞计数;

　　1012——g 和pg 单位转换。

　　13 白细胞计数(WBC)

　　13.1 Natt-Herrick’s 方法

　　按以下步骤操作：

　　a) 取 4 mL Natt-Herrick’s 溶液到5 mL 离心管中;

　　b) 吸取 20 μL 混匀抗凝全血，擦拭吸头尖端的外部，将全血打入Natt-Herrick’s 溶液中;

　　c) 孵育 15 min ~ 30 min;

　　d) 使用血液混匀器或手动轻轻上下翻转将液体混匀;

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　　e) 使用干净、干燥的血细胞计数板，固定血盖片，用移液器吸取少量混匀液体分别放入血细胞计

　　数板上的两个计数池，避免气泡进入;

　　f) 将滤纸放在培养皿中，用蒸馏水轻轻润湿滤纸;

　　g) 将棉拭子头掰掉，将2 根棉棒棍，放在带盖培养皿的底部;

　　h) 装载血的血细胞计数板架在2 根棉棒棍上，盖上培养皿避免脱水;

　　i) 等待 5 min，细胞沉淀;

　　j) 显微镜(400×)计数：计数两个计数池中各9 个大方格内的白细胞总数，计算出平均值。

　　k) 计算：白细胞计数(WBC)用一个保留两位小数的数值×109/L 表示，计算见公式(6)：

　　WBC (/L)= N9WBC ×1.1 ×200 ×106 ……………………………(6)

　　式中：

　　N9WBC——9 个大方格白细胞数(两个计数池中18 个大方格内白细胞总数除以2);

　　1.1——计算系数;

　　200——稀释倍数;

　　106——μL 和L 单位转换。

　　13.2 血涂片估算法白细胞计数

　　血涂片估算法白细胞计数按以下步骤操作：

　　a) 制作一张标准血涂片(血涂片制作、阅片方法见附录B);

　　b) 用瑞氏-吉姆萨染色液对玻片进行染色;

　　c) 显微镜下观察，常用目镜10×，物镜40×，在单层细胞的区域内，计数10 个视野白细胞总数;

　　d) 血涂片估算法白细胞计数(WBC)用一个保留两位小数的数值×109/L 表示，计算见公式(7)：

　　WBC (/L)= N10WBC/10 ×WJ 2 × 106 …………………………(7)

　　式中：

　　N10WBC——10 个视野白细胞总数;

　　WJ——目镜放大10 倍时，物镜的放大倍数，通常为40;

　　106——μL 和L 单位转换。

　　注:在哺乳动物中，人工变异系数为30 %;爬行动物中不同物种间没有明确的统计分析数据，但在对患病动物进行

　　比较和检测应注意这种差异。

　　13.3 不同白细胞绝对值的计算

　　不同白细胞绝对值的计算如下：

　　a) 白细胞进行分类：显微镜(1 000×)观察染色血涂片(见附录B)，计数100 个白细胞，统计

　　出异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞所占百分比;

　　b) 某种白细胞绝对值(WBCX)计算见公式(8)：

　　WBCX(/L)= Nx × WBC ……………………………(8)

　　式中：

　　NX ——某种白细胞所占百分比;

　　WBC——白细胞计数。

　　14 凝血细胞计数

　　凝血细胞计数采用血涂片估算法，按以下步骤操作：

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　　a) 显微镜观察染色血涂片(见附录B)，计数单层细胞区域10 个视野凝血细胞数;

　　b) 凝血细胞计数(Thr)用一个整数×109/L 表示，计算见公式(9)：

　　Thr(/L)= N10Thr /10 × WJ 2 × 106 …………………………(9)

　　式中：

　　N10Thr——10 个视野凝血细胞总数;

　　WJ——目镜放大10 倍时，物镜的放大倍数，通常为40;

　　106——μL 和L 单位转换。

　　注：凝血细胞平均小于1 个提示凝血细胞减少，凝血细胞平均大于5 个提示凝血细胞增多;实际凝血细胞计数很难

　　确定，因为凝血细胞容易聚集，因此外周血涂片估计，凝血细胞浓度经常被描述为正常、升高或降低。

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　　7

　　附 录 A

　　(规范性)

　　Natt-Herrick’s 染液配制及细胞染色特征

　　A.1 Natt-Herrick’s染液配制

　　Natt-Herrick’s染液的配制见表A.1。

　　表A.1 染液成分及用量

　　成分 用量

　　NaCl 3.88 g

　　Na2SO4 2.5 g

　　Na2HPO4.12H2O 2.91 g

　　KH2PO4 0.25 g

　　40 %甲醛7.5 mL

　　龙胆紫0.1 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　注1：将上述化学品按表中的顺序溶解在蒸馏水中，并在容量瓶中稀释至总体积为1 000 mL。孵育12 h后，溶液经精

　　细滤纸过滤，调溶液的pH至7.3。

　　注2：过滤之前，孵育12小时。

　　A.2 保定环境

　　A.2.1 红细胞

　　大的卵圆形红细胞的细胞核呈紫色，细胞质也呈紫色，但紫色程度明显较小。由于红细胞的形状是

　　比较一致大卵圆形，所以将其与白细胞和凝血细胞区分开来。

　　A.2.2 白细胞

　　白细胞的细胞核被染成深蓝紫色，细胞质染成浅蓝色。有些物种的淋巴细胞和散在分布的凝血

　　细胞很难区分。

　　A.2.3 凝血细胞

　　血液中最小的细胞，这种细胞通常呈椭圆形，细胞核染成浅紫色，细胞质通常是无色的，但有

　　些可以染成淡蓝色。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　血涂片

　　B.1 准备血涂片(最常用)

　　准备血涂片最常用的方法如下：

　　a) 在载玻片的磨砂端或起始端标记姓名;

　　b) 在载玻片靠近上起始端滴一滴混合均匀的血;

　　c) 一手固定载玻片，另一手用拇指和食指持盖玻片;

　　d) 将盖玻片的一端置于血滴的前方，与载玻片呈30 ~ 45 度夹角。将盖玻片稍微往后触碰血滴，

　　此时血液会沿着推片边缘扩散。扩散完成后立即向前推去;

　　e) 将玻片在空气中轻轻挥动风干，或用吹风机吹干。

　　B.2 血涂片分区

　　血涂片不同区域及作用如下：

　　——血涂片包括三个区域：体部或基部，单层区域，羽状区(边缘);

　　——体部或基部一般较厚，细胞通常收缩、扭曲，染色不良，无法进行可靠的评估;

　　——单层区红细胞紧挨着，但几乎不接触，细胞形态舒展，是单个细胞形态评估、白细胞计数最佳

　　的区域;

　　——羽状区是寻找微生物(微丝蚴)、聚集凝血细胞、大型非典型细胞、肿瘤细胞等的最佳区域。

　　B.3 血涂片染色

　　血涂片染色方法如下：

　　a) 滴加瑞氏-吉姆萨染液A 溶液( 0.5 ml ~ 1 ml )于标本上;

　　b) 将瑞氏-吉姆萨染液B 溶液滴加于A 液上面，滴加量为A 液的2 ~ 3 倍，用洗尔球吹匀，

　　使两液充分混匀，染色5 min ~ 10 min;

　　c) 用蒸馏水水洗、干燥后镜检。

　　B.4 血涂片读片

　　血涂片读片方法如下：

　　a) 先用低倍镜(100 ×)快速扫描整个血涂片，从体细胞区到单层区到羽状缘;

　　b) 在低倍镜下，可以检查血涂片的染色、整体厚度、细胞分布、单层面积、背景等，羽状缘观察

　　聚集的凝血细胞、大型寄生虫和大型非典型细胞;

　　c) 单层区域观察适合评估细胞形态状况;

　　d) 再用高倍镜(400 ×)或油镜(1000 ×)观察识别。

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