T/CVMA 364-2026 华支睾吸虫病诊断技术

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　团 体 标 准

　　T/CVMA 364—2026

　　华支睾吸虫病诊断技术

　　Diagnostic techniques for c lonorchiasis

　　2026 - 4 - 1 发布 2026 - 4 - 1 实施

　　中国兽医协会 发 布

　　T/CVMA 364—2026

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由吉林大学提出。

　　本文件由中国兽医协会归口。

　　本文件起草单位：吉林大学、中山大学、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所。

　　本文件主要起草人：刘晓雷、刘明远、唐斌、白雪、王学林、丁静、李辰、金雪敏、徐凝、余新炳、黄艳、洪炀。

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　　华支睾吸虫病诊断技术

　　1 范围

　　本文件规定了华支睾吸虫囊蚴和虫卵的形态学和PCR鉴定方法。

　　本文件适用于鱼类肌肉组织样品中华支睾吸虫囊蚴和哺乳动物粪便样品中华支睾吸虫虫卵的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　bp：碱基对(base pair)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)

　　EB：溴化乙锭(ethidium bromide)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸(tris-acetate-EDTA)

　　5 形态学方法

　　5.1 器材

　　5.1.1 生物显微镜：100×~ 400×。

　　5.1.2 体视显微镜。

　　5.1.3 离心机。

　　5.1.4 绞肉机。

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　　5.1.5 37 ℃恒温箱。

　　5.1.6 磁力搅拌器、磁力搅拌子。

　　5.1.7 手术剪、镊子。

　　5.1.8 试管(10 mL)、橡皮塞。

　　5.1.9 微量可调移液器。

　　5.1.10 载玻片、盖玻片。

　　5.1.11 烧杯(1 L)。

　　5.1.12 尼龙绢(80 目)。

　　5.1.13 塑料刮片。

　　5.1.14 塑料定量板：中央孔呈圆台形，短径 3 mm，长径 4 mm，高 1 mm，容积为 38.75 mm3。

　　5.1.15 亲水玻璃纸：规格为 40 μm 厚，裁剪成 25 mm×40 mm 大小，使用前在透明液中浸泡24 h 以上，至玻璃纸呈现绿色。

　　5.2 试剂

　　5.2.1 盐酸溶液：36 % HCl 溶液。

　　5.2.2 生理盐水：0.9 % NaCl 溶液。

　　5.2.3 透明液：由纯甘油 100 mL、3%孔雀绿(或亚甲基蓝)水溶液 1 mL 和蒸馏水 100 mL 配制而成。

　　5.2.4 乙醚。

　　5.2.5 胃蛋白酶(1:3000)。

　　5.2.6 胃蛋白酶消化液。

　　5.3 压片法

　　5.3.1 样品制备

　　将待检的淡水鱼清洗干净，去除体表黏液，用剪刀挑开鱼背部皮肤，从皮下剪取 2 份~ 3 份黄豆粒大小的鱼肉，放在两张载玻片之间，用力将鱼肉压薄，将载玻片两端用细线扎紧。

　　5.3.2 镜检

　　将玻片置于生物显微镜(放大倍数4×10或10×10)下观察有无华支睾吸虫囊蚴。

　　5.3.3 结果判定

　　显微镜下观察到符合附录A中图A.1特征的华支睾吸虫囊蚴，可判定为华支睾吸虫感染。

　　5.4 消化法

　　5.4.1 样品制备

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　　取待检的淡水鱼的肌肉组织，清洗干净，用剪刀剪碎或用绞肉机低速搅碎。

　　5.4.2 消化

　　取样品100 g置于1 L烧杯中，加入1 L胃蛋白酶消化液(见附录B的B. 1)，搅拌均匀，放入磁力搅拌子，于37 ℃恒温箱内用磁力搅拌器进行搅拌消化，直至鱼肉完全消化为止。可根据不同种类的鱼以及胃蛋白酶活力和使用量适当调整消化时间。

　　5.4.3 镜检

　　消化液静置，弃去上层液体，取全部沉淀物至玻璃平皿，在体视显微镜下去除沉淀中的杂质，分离、收集疑似囊蚴，用生物显微镜观察。

　　5.4.4 结果判定

　　显微镜下观察到符合附录A中图A.1特征的华支睾吸虫囊蚴，可判定为华支睾吸虫感染。

　　5.5 直接涂片法

　　5.5.1 取样

　　在载玻片中央滴加生理盐水或清水1滴 ~ 2滴，用干净竹签挑取少量粪便样品与水滴充分调和，剔除大的粪渣，涂布均匀，涂面大小约为1.5 cm×2.5cm，涂布成能透过其看到纸上字迹的薄层为宜。检测的粪便应该是新鲜的粪便，如果不能立即检测，可先置于4 ℃环境。

　　5.5.2 镜检

　　每份标本应涂片三张，在生物显微镜下仔细查找虫卵，并将三张涂片全部检查完毕。

　　5.5.3 结果判定

　　显微镜下观察到符合附录A中图A.2特征的华支睾吸虫虫卵，可判定为华支睾吸虫感染。

　　5.6 改良加藤厚涂法

　　5.6.1 取样

　　取1 g ~ 2 g新鲜粪便，将一块尼龙绢覆盖于粪便样本上，用塑料刮片轻刮尼龙绢，将刮取的粪便置于载玻片上的塑料定量板中央，用刮板将粪便填满中央孔内并抹平。取下定量板，将亲水玻璃纸盖在粪便上，用载玻片轻压，使粪便均匀展开至玻璃纸边缘，至粪膜变透明，透明时间不宜超过2h。

　　5.6.2 镜检

　　用生物显微镜进行检查整张涂片。

　　5.6.3 结果判定

　　显微镜下观察到符合附录A中图A.2特征的华支睾吸虫虫卵，可判定为华支睾吸虫感染。

　　5.7 盐酸乙醚离心沉淀法

　　5.7.1 取样

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　　称取1 g粪便放入试管中，加入盐酸溶液4 mL ，混匀，用镊子挑去大块粪渣，用橡皮塞塞紧管口，摇匀后静置3 min ~ 5 min，再加入乙醚2 mL ，塞紧橡皮塞，摇匀，1000 r/min ~ 1500 r/min离心3 min ~ 5 min。管内分为四层，即从上至下分别为乙醚、粪便层、盐酸及细粪渣和虫卵沉淀物，弃去上层，仅保留虫卵沉淀物。

　　5.7.2 镜检

　　取虫卵沉淀物置于载玻片上，直接镜检或加盖玻片后镜检。

　　5.7.3 结果判定

　　显微镜下观察到符合附录A中图A.2特征的华支睾吸虫虫卵，可判定为华支睾吸虫感染。

　　6 PCR 方法

　　6.1 器材

　　6.1.1 PCR 仪。

　　6.1.2 高速离心机。

　　6.1.3 恒温水浴锅。

　　6.1.4 电泳仪。

　　6.1.5 凝胶成像系统。

　　6.1.6 微量可调移液器。

　　6.1.7 无 DNA 酶污染的离心管。

　　6.1.8 PCR 反应管。

　　6.1.9 无 DNA 酶污染的吸头。

　　6.2 试剂

　　6.2.1 10×PCR 缓冲液。

　　6.2.2 Ex Taq 酶：5 U/μL。

　　6.2.3 dNTP 预混液：2.5 mmol/L。

　　6.2.4 MgCl2 ：25 mmol/L。

　　6.2.5 电泳缓冲液：l×TAE 缓冲液(见附录 B.2)。

　　6.2.6 普通核酸电泳用琼脂糖。

　　6.2.7 电泳加样缓冲液(见附录 B.3)。

　　6.2.8 DNA 分子质量标准：分子大小范围包含 750 bp ~ 1000 bp。

　　6.2.9 10 mg/mL 溴化乙锭或其他核酸染料。

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　　6.2.10 阳性对照：选择经验证的华支睾吸虫囊蚴或虫卵 DNA ，作为阳性对照。

　　6.2.11 阴性对照：选择未感染华支睾吸虫的鱼肉样本或动物粪便 DNA 或蒸馏水，作为阴性对照。

　　6.3 引物

　　根据华支睾吸虫核糖体DNA参考序列设计PCR扩增特异性引物(参考序列见附录C)，PCR反应用上、下游引物序列见附录D中D.1。

　　6.4 核酸提取

　　取待鉴定的虫卵或囊蚴，使用经验证的商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

　　6.5 PCR 反应体系

　　PCR反应体系见D.2。

　　6.6 PCR 反应程序

　　PCR反应程序见D.3。

　　6.7 扩增产物电泳检测

　　称取1.5 g 琼脂糖，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热融化后加入5 mL EB，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样本数选用适宜的梳子。待凝胶冷却后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加入l×TAE缓冲液至胶面全部浸入液面。取10 μL PCR扩增产物和2 μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设DNA分子质量标准、阴性对照和阳性对照，用凝胶成像系统观察和记录结果。

　　6.8 试验成立条件

　　阳性对照样本有一条860 bp扩增条带，阴性对照没有条带或仅有引物二聚体条带，则试验成立，结果有效。

　　6.9 结果判定

　　被检样品无条带，则判定为华支睾吸虫囊蚴/虫卵核酸阴性，表述为“未检出华支睾吸虫囊蚴/虫卵核酸”;如被检样品有条带，大小为860 bp，则判定为华支睾吸虫囊蚴/虫卵核酸阳性，表述为“检出华支睾吸虫囊蚴/虫卵核酸”。阳性样品可进行测序进一步确证。

　　7 综合判定

　　压片法和消化法检出华支睾吸虫囊蚴或直接涂片法、改良加藤厚涂法和盐酸乙醚离心沉淀法检出华支睾吸虫虫卵，均可判定为华支睾吸虫感染。

　　压片法和消化法无法明确判定沉淀物为华支睾吸虫囊蚴，或直接涂片法、改良加藤厚涂法和盐酸乙醚离心沉淀法无法明确观察到的物体为华支睾吸虫虫卵，均需再用PCR方法鉴定。若PCR结果为阳性，可判定为华支睾吸虫感染;若PCR结果为阴性，可判定为非华支睾吸虫囊蚴或虫卵。

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　华支睾吸虫形态学方法结果判定示意图

　　华支睾吸虫囊蚴镜下形态判定示意图见图 A. 1，虫卵形态判定示意图见图 A.2。

　　华支睾吸虫囊蚴一般呈椭圆形或卵圆形，平均大小为 0.15 mm ~ 0.17 mm×0.13 mm ~ 0.15 mm，囊壁有两层，透明，外壁较厚，约 3 μm ~ 4 μm，内壁较薄，囊内有蜷曲活动的虫体，口吸盘和腹吸盘大小相近，排泄囊呈黑色团状。注意鉴别诊断华支睾吸虫囊蚴与东方次睾吸虫囊蚴：东方次睾吸虫囊蚴与华支睾吸虫囊蚴大小差异不明显，囊壁较华支睾吸虫囊蚴囊壁厚，呈双层结构。

　　华支睾吸虫虫卵呈黄褐色，形似芝麻，大小为 27 μm ~ 35 μm×12 μm ~ 20 μm 前端较窄，有小盖和肩峰。后端钝圆，尾部有小疣。

　　图A.1 华支睾吸虫囊蚴与东方次睾吸虫囊蚴形态示意图

　　图A.2 华支睾吸虫虫卵形态示意图

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　相关试剂的配制

　　B.1 胃蛋白酶消化液

　　盐酸溶液(36%) 10 mL

　　加入双蒸水至 1000 mL

　　胃蛋白酶 10 g

　　消化液现用现配，用前预热至37℃。

　　用800 mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至1000 mL ，常温保存备用。

　　B.3 1×TAE使用液

　　50×TAE贮存液 10 mL

　　去离子水 490 mL

　　混匀，常温保存备用。

　　B.4 电泳加样缓冲液

　　溴酚蓝 0.25 g

　　丙三醇(甘油) 30 mL

　　双蒸水 70 mL

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　华支睾吸虫核糖体 DNA 参考序列

　　C.1 华支睾吸虫核糖体DNA参考序列(GenBank Accession No. MK450524. 1)

　　5 ,-TACCCAATATATATGATGTGCCTACGTACAGTCGCGTTTCGGCAGGGTGCCTACCCGTCTGAT GCTCTCGGTATGCTCGCTTCCGTTGGTGGCCAGTCCATATTGGGGGTGACGGGATGTGCTGTCAGA ATGGACAGTGCTAGGCTTAATGAGTGGGCATGATGTGTCTCGAGCTACGGCTCACCCACCGCCCTG ATGTTGTTGTTCATTTCAAACCGTTTTACACTGTTAAAGTGTTTCAGGTTGGCGTGGCCTGACTGGC TGGCCGGCTTGTCTCACTGCCCCGACATGCACCCGGTGTTCTACACTGGACTGCATGTGCAGTCGC CCGGCGGTGCCTTATCCCGGGTACGACTGATAACGCCTCGGTCATCTGGGTTACCAGTTGATTGAG ATGAGTACAACTCTGAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTG TGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCATGGGTT TGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCACGACGCCCAAAAAGTCGTGGCT TGGGTCTTGCCAGCTGGCATGATTTCCCCACACAATTGTGTGTATGTGTGTGGGGTGCCGGATCTAT GGCTTTTCCCCAATGTGCCGGACGCAACCATGTCTGGGCTGACTGCCTAGATGAGGGGGTGGCGG CGGAGTCGTGGCTCAATTGTTGTTATTGTTGTGAATGTGCGCGCTCCGTTGTTGGTCCTTTGTCTTT GGTTGAGGCTTCAGTATTGGCAATGCATTCGATGCAAATCTGTTTTGCACCGGTCGGTGCTTAACTT TC-3,

　　注：下划线为引物序列。

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　　附 录 D

　　(资料性)

　　PCR 扩增特异性引物、反应体系和反应程序

　　D.1 PCR扩增特异性引物序列

　　华支睾吸虫PCR扩增引物的名称与序列见表D.1。

　　表D.1 华支睾吸虫PCR扩增引物序列

　　注：上下游引物工作浓度均为10 μmol/L。

　　D.2 PCR反应体系

　　PCR扩增反应体系见表D.2。

　　表D.2 PCR扩增反应体系(25 μL)

　　D.3 PCR反应程序

　　PCR反应程序见表D.3。

　　表D.3 PCR扩增反应程序

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