DB23/T 3897-2024 基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程

《DB23/T 3897-2024 基于⁶⁰Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程》的详细内容总结：

​1. 范围​

适用于利用⁶⁰Coγ辐射诱变技术创制秸秆降解真菌种质资源的筛选与鉴定，涵盖菌株创制、筛选鉴定、保藏及档案管理全过程。

​2. 规范性引用文件​

包括辐射安全（GB 10252、GB/T 17568）、酶活测定（GB/T 23874、NY/T 3494）、微生物保藏（SN/T 2632）及生物多样性观测（HJ 710.11）等标准。

​3. 术语和定义​

• ​秸秆降解真菌​：能分解作物秸秆的产孢丝状真菌。

​4. 秸秆降解真菌创制​

​4.1 菌种来源​

• 从自然环境分离的秸秆降解真菌，-80℃冻存备用。

​4.2 培养方法​

• ​培养基​：
  • PDA培养基（活化用）：马铃薯浸出粉12g、葡萄糖20g、琼脂15g/L。
  • 高粱粒培养基（产孢子）：高粱粒5g、水5mL。
  • 产酶培养基（MA）：含磷酸盐、氮源、微量元素等，pH 5.5。
• ​孢子悬浮液制备​：
  孢子浓度稀释至10⁶~10⁷ CFU/mL（生理盐水洗脱，血球计数板校准）。

​4.3 辐射处理​

• ​辐射剂量​：⁶⁰Coγ射线 ​2000 Gy。
• ​装置要求​：符合GB/T 17568和GB 10252的辐射安全规范。

​5. 突变菌株筛选鉴定​

​5.1 筛选流程​

1. ​致死率筛选​：
   • 计算公式：LR = (C_c - C_T) / C_c × 100%（C_c：对照组菌落数；C_T：辐射组菌落数）。
   • ​筛选标准​：致死率 ​**≥85%​**​ 的菌株进入下一轮。
2. ​形态学筛选​：
   • 诱变菌株在PDA平板上培养，对比原始菌株的菌落形态差异（颜色、大小、边缘等）。
3. ​酶活力测定​：
   • ​纤维素酶与半纤维素酶​：
     • ​内切葡聚糖酶​：以CMC-Na为底物，DNS法测还原糖（单位：U = μmol/min）。
     • ​外切葡聚糖酶​：以pNPC为底物，测420nm吸光度（单位：U）。
     • ​β-葡萄糖苷酶​：以水杨苷为底物，DNS法测酶活（单位：U）。
     • ​木聚糖酶​：按GB/T 23874分光光度法测定。
   • ​木质素降解酶​：
     • ​漆酶​：ABTS为底物，420nm测吸光度（ε=36,000 L·mol⁻¹·cm⁻¹）。
     • ​锰过氧化物酶​：Mn²⁺为底物，240nm测吸光度（ε=6,500 L·mol⁻¹·cm⁻¹）。
     • ​木质素过氧化物酶​：藜芦醇为底物，310nm测吸光度（ε=9,300 L·mol⁻¹·cm⁻¹）。
4. ​秸秆降解率验证​：
   • 选取酶活前50%的菌株，在土壤悬浮液中降解秸秆（15℃培养2周）。
   • 按NY/T 3494测定木质素（LD）、纤维素（CD）、半纤维素（HD）降解率：
     markdown
     markdown
     复制
     markdown
     复制

     LD = (M1 - M2) / M1 × 100%  CD = (M3 - M4) / M3 × 100%  HD = (M5 - M6) / M5 × 100%  

     
     （M1/M3/M5：对照组含量；M2/M4/M6：处理组含量）

​5.2 分子生物学鉴定​

• 按HJ 710.11提取DNA，进行ITS序列分析确定菌种分类地位。

​6. 菌株保藏​

• 经鉴定的高效菌株按SN/T 2632进行冷冻干燥或液氮保藏。

​7. 档案管理​

• 全程记录菌株来源、辐射参数、筛选数据、鉴定结果等，确保可追溯性。

​技术核心要点​

1. ​关键参数​：
   • 辐射剂量固定为 ​2000 Gy，致死率阈值 ​**≥85%​**。
   • 酶活测定标准化（温度、底物浓度、反应时间严格统一）。
2. ​筛选层级​：
   致死率 → 形态差异 → 酶活力 → 秸秆降解率 → 分子鉴定，多级递进筛选。
3. ​应用导向​：
   结合土壤环境模拟降解实验，确保菌株实际应用有效性。

此规程为黑龙江省秸秆降解真菌种质资源创制提供了标准化技术路径，适用于农业废弃物资源化利用的科研与产业化应用。