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JJF(京) 171-2025 便携式恒温扩增核酸分析仪校准规范

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资料介绍

　　北京市地方计量技术规范

　　JJF(京)171—2025

　　便携式恒温扩增核酸分析仪校准规范

　　Calibration Specification for Portable Isothermal

　　Amplification NucleicAcidAnalyzers

　　2025-06-13 发布 2025-07-01实施

　　北京市市场监督管理局发布

　　Calibration Specification for Portable IsothermalAmplification NucleicAcidAnalyzers

　　归口单位：北京市市场监督管理局

　　主要起草单位：北京市计量检测科学研究院北京市食品检验研究院

　　北京市大兴区计量检测所

　　本规范委托北京市计量检测科学研究院负责解释

　　本规范主要起草人：

　　赵雨佳(北京市计量检测科学研究院)宋丽萍(北京市食品检验研究院)

　　张越(北京市大兴区计量检测所)参加起草人：

　　梁亮(北京市计量检测科学研究院)

　　李冉(北京市计量检测科学研究院)

　　刘然(北京市计量检测科学研究院)范培蕾(北京市计量检测科学研究院)

　　引言 (II)

　　1范围 (2)

　　2引用文件 (2)

　　3术语 (2)

　　4概述 (2)

　　5计量特性 (1)

　　6校准条件 (2)

　　6.1环境条件 (2)

　　6.2 测量标准及其他设备 (2)

　　7 校准项目和校准方法 (2)

　　7.1 温度示值误差 (3)

　　7.2 温度均匀度 (4)

　　7.3 温度波动度 (4)

　　7.4 荧光强度重复性或浊度重复性 (4)

　　7.5 荧光强度线性或浊度线性 (5)

　　7.6 样本检测重复性 (5)

　　8 校准结果表达 (5)

　　9复校时间间隔 (6)

　　附录A 核酸标准物质、荧光溶液以及浊度标准物质配制及使用示例 (7)

　　附录B 示值误差的不确定度评定示例 (8)

　　附录C 校准记录格式(推荐) (10)

　　附录D 校准证书内页格式(推荐) (12)

　　引言

　　JJF1071《国家计量校准规范编写规则》、JJF1001《通用计量术语及定义》、JJF1059.1《测量不确定度评定与表示》共同构成支撑本规范制修订工作的基础性系列规范。参考了JJF1527-2015《聚合酶链式反应分析仪校准规范》和GB/T 41407-2022《微流控芯片核酸恒温扩增仪技术要求》的相关内容。

　　本规范为首次发布。

　　便携式恒温扩增核酸分析仪校准规范

　　1范围

　　本规范适用于便携式恒温扩增核酸分析仪的校准。

　　2引用文件

　　JJF1527 聚合酶链式反应分析仪校准规范

　　GB/T 41407 微流控芯片核酸恒温扩增仪技术要求

　　凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本规程;凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规程。

　　3术语

　　GB/T 41407界定的以及下列术语和定义适用于本规范。

　　3.1 核酸恒温扩增 nucleic acid isothermal amplification

　　由常温升温至特定温度后，在该温度下进行核酸体外扩增的过程。

　　[来源：GB/T 41407-2022, 3.1]

　　3.2 指数级扩增拐点时间 time ofexponent amplification crossing point

　　在实时监测核酸样本扩增过程中，扩增产物产生的荧光信号(或浊度信号)达到指数级扩增阈值经过的时间。

　　[来源：GB/T 41407-2022, 3.7]

　　4概述

　　便携式恒温扩增核酸分析仪(以下简称“分析仪”)是基于核酸恒温扩增原理，在模板(待测样品)、聚合酶、引物等存在的条件下，在特定的扩增温度下，进行核酸序列的特异性扩增，通过光学系统采集核酸扩增产物产生的光信号(荧光强度或浊度引起的变化)，进一步通过光电转换生成数据文件，从而实现核酸样品分析。

　　便携式恒温扩增核酸分析仪主要由控制系统、电源系统、温控系统和检测系统等组成。

　　5计量特性

　　计量特性指标见表1。

　　表1 便携式恒温扩增核酸分析仪计量特性

　　计量特性技术指标温度示值误差 ±0.5℃ 温度均匀度 ≤1.0℃ 温度波动度 ±0.5℃ 荧光强度重复性或浊度重复性 ≤10% 荧光强度线性或浊度线性 푟≥0.990 样本检测重复性* ≤10% 注：1、以上技术指标不适用于合格判别，仅供参考。

　　*2、对于只检测RNA的仪器，该项目可选做。 6 校准条件

　　6.1环境条件

　　6.1.1 环境温度：(15～30)℃。

　　6.1.2 环境湿度：(20～85)% RH。

　　6.2测量标准及其他设备

　　6.2.1 温度测量仪：由若干个(通常为3 个、5 个、7 个)温度传感器，数据采集分析模块组成，测温范围(0~120)℃,分辨力≥0.1℃,扩展不确定度≤0.1℃(k=2)。

　　6.2.2 核酸标准物质：校准时应采用经计量行政部门批准发布的核酸标准物质，其特性量值≥102copies/μL，相对扩展不确定度≤10%(k=2)。

　　6.2.3 浊度标准物质：校准时应采用经计量行政部门批准发布的浊度标准物质，浊度测量范围应满足分析仪要求，相对扩展不确定度应≤5%(k=2)。

　　6.2.4 荧光标准溶液：根据仪器的荧光通道类型，选择具有合适发射和激发波长的荧光物质，配制合适浓度的荧光标准溶液。配制方法可参考附录A。

　　6.2.5电子天平：分度值≤0.01 mg，○I级。

　　6.2.6 秒表：最小分度值≤0.01 s，最大允许误差为±0.5 s/d。

　　6.2.7 移液器：规格10μL、100μL、1000μL。

　　6.2.8 超纯水：电阻率≥18.2 MΩ·cm(25℃)。

　　7 校准项目和校准方法 7.1温度示值误差

　　将温度传感器固定在分析仪的加热模块上，保证温度传感器与加热模块贴合紧密，尽量保证均匀分布。测温点位个数要求如下：当仪器总孔位数大于48 且小于等于96 个，应选择7 个测温点;当仪器总孔位数大于8 个且小于等于48个，应选择5 个测温点;当仪器总孔位数大于2 个且小于等于8 个，应选择3 个测温点;当仪器总孔位数小于或等于2个，应选择1 个孔位，进行5次重复测量。温度传感器排布位置可参考图1。

　　图1 温度传感器排布位置示意图。A)微流控加热模块;B)8 孔加热模块;C)16 孔加热模块;D)32

　　孔加热模块;E)48 孔加热模块;F)96 孔加热模块。

　　设定分析仪的温度(应与常用的恒温扩增温度一致)，运行仪器，待被校分析仪的温度稳定后，读取温度传感器的温度测量值，按公式(1)计算温度示值误差。

　　ΔTd = Ts− T-c(1)

　　式中：

　　ΔTd——温度示值误差，℃;

　　Ts——温度设定值，℃;

　　T(-)-——温度测量值的平均值，℃。

　　7.2温度均匀度

　　按7.1 要求进行温度传感器布置和仪器温度设置，待被校分析仪温度达到设定温度，且温度稳定后，读取所有温度传感器的温度测量值，按公式(2)计算温度均匀度，选最大值作为温度均匀度。

　　∆푇u=푇max−푇min(2)

　　式中：

　　∆푇푢——温度均匀度，℃;

　　푇max——所有测温传感器测量值的最大值，℃;

　　푇min ——所有测温传感器测量值的最小值，℃。

　　7.3温度波动度

　　按7.1 要求进行温度传感器布置和仪器温度设置，待被校仪器温度达到设定温度，且温度稳定后，连续测量10 min，每隔1 min 记录一次所有温度传感器的平均值，作为本次记录的温度测量值，共记录10次，按公式(3)计算温度波动度。

　　式中：

　　∆푇푤——温度波动度，℃;

　　-ax(--)——10次温度测量值中的最大值，℃;

　　-in(--)——10次温度测量值中的最小值，℃。

　　7.4 荧光强度重复性或浊度重复性

　　配制合适浓度的荧光标准溶液或合适浊度的浊度标准溶液，使得仪器测量值处于仪器测量范围的中间值附近，重复测量6次，记录仪器的测量值，按公式(4)计算仪器测量值的相对标准偏差作为重复性。

　　푅푆퐷퐼——仪器测量值的相对标准偏差，%;

　　—푖——次(第푖)仪器测量值的平(次仪器的测量值)，均值(单)位，单位采用仪器(采用仪器自身)自(物)身物理量(理量单位);单位。 7.5荧光强度线性或浊度线性

　　将稀释的系列荧光标准溶液或浊度标准溶液(至少5 个梯度使得测量值均匀覆盖仪器测量范围)进行测量，每个梯度重复测量3次，将标准溶液的标准值与仪器的测量值进行线性回归，按公式(5)计算其线性回归系数푟。

　　式中：

　　푟——线性相关系数;

　　푋푖——第푖个标准溶液的标准值，ng/g或NTU;

　　푋-——标准值的平均值，ng/g或NTU;

　　푌푖——第푖个标准溶液对应的仪器测量值，单位采用仪器自身物理量单位;

　　——仪器测量值的平均值，单位采用仪器自身物理量单位。

　　7.6样本检测重复性

　　将核酸标准物质稀释到(100~1000)copies/μL，作为待测样品进行恒温扩增，重复测量6次，记录其指数级扩增拐点时间，按公式(6)计算其相对标准偏差作为样本检测重复性。

　　푅푆퐷푡——指数级扩增拐点时间的相对标准偏差，%;

　　—푖——次(第푖)样本指数级扩增拐点时间的平均值(次样本指数级扩增拐点时间的测量)值，，min(m)i。n;

　　8 校准结果表达

　　校准结果应在校准证书上反映。校准证书应至少包括以下信息：

　　a) 标题：“校准证书”;

　　b)实验室名称和地址;

　　c) 进行校准的地点(如果与实验室的地址不同);

　　d)证书或报告的唯一性标识(如编号)，每页及总页数的标识;

　　e) 客户的名称和地址;

　　f)被校对象的描述和明确标识;

　　g)进行校准的日期，如果与校准结果的有效性和应用有关时，应说明被校对象的接收日期;

　　h)如果与校准结果的有效性和应用有关时，应对被校样品的抽样程序进行说明;

　　i) 校准所依据的技术规范的标识，包括名称及代号;

　　j)本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明;

　　k)校准环境的描述;

　　l)校准结果及其测量不确定度的说明;

　　m)对校准规范偏离的说明;

　　n)校准证书签发人的签名、职务或等效标识以及签发日期;

　　o)校准结果仅对被校对象有效的声明;

　　p)未经实验室书面批准，不得部分复制证书或报告的声明。

　　9 复校时间间隔

　　建议复校时间间隔一般不超过一年。复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等因素决定，送校单位也可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。如果仪器经维修、更换重要部件或对仪器性能有怀疑时，应重新校准。附录A

　　核酸标准物质、荧光溶液以及浊度标准物质配制及使用示例

　　A.1 核酸标准物质的配制

　　用TE缓冲溶液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0)作为稀释液将核酸标准物质稀释至(100~1000)copies/μL 浓度。

　　A.2 荧光标准溶液的配制

　　称取1.0 mg荧光物质，如5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5-FAM 琥珀酰亚胺酯)，溶于1 g DMSO中，充分混匀得到1 mg/g的荧光标准溶液母液。然后将荧光标准溶液母液梯度稀释至工作标准液浓度：首先称取100 mg1 mg/g荧光标准溶液母液加入到900 mg DMSO中，充分混匀，将溶液稀释至0.1 mg/g;然后称取100 mg 0.1 mg/g的荧光溶液加入到900mg DMSO中，充分混匀，将溶液稀释至0.01 mg/g 作为工作标准溶液待用。使用时取适量0.01mg/g的工作标准溶液用Tris-HCl缓冲溶液(10 mmol/LTris-HCl，pH=8.0)作为稀释液，分别稀释至100 ng/g、80 ng/g、60 ng/g、40 ng/g和20 ng/g作为荧光标准溶液。在用于重复性检测及线性检测时，浓度应根据仪器测定范围进行调整。

　　A.3 浊度标准溶液的配制

　　首先，配制零浊度水，选用孔径不大于0.2 μm的微孔滤膜过滤蒸馏水(或电渗析水、离子交换水)，反复过滤2次以上，所获得的滤液即为零浊度水。其次，用零浊度水将浊度标准物质(比如 GBW(E)120113，4000 NTU)稀释至2000 NTU、1000 NTU、500 NTU、250 NTU。最后以4000 NTU、2000 NTU、1000NTU、500 NTU、250 NTU系列梯度的浊度溶液用于线性检测。

　　附录B

　　温度示值误差的不确定度评定示例

　　B.1概述

　　将温度测量仪的温度传感器固定在仪器的加热模块上，保证温度传感器与加热模块贴合紧密。设定仪器的温度(一般应与仪器常用的恒温扩增温度一致)，运行仪器，待分析仪温度稳定后，读取温度传感器的温度测量值。

　　B.2 测量模型

　　∆푇d=푇s−푇-c(1)

　　式中：

　　∆푇푑——温度示值误差，℃;

　　푇s——温度速设定值，℃;